豬原環病毒2型衣殼蛋白含量與抗原滴度的相關性研究

朱瑩瑩，榮 俊 (長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

匡紅艷 (長江大學臨床醫學院，湖北 荊州 434000)

豬原環病毒2型衣殼蛋白含量與抗原滴度的相關性研究

朱瑩瑩，榮 俊 (長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

匡紅艷 (長江大學臨床醫學院，湖北 荊州 434000)

將豬圓環病毒2型衣殼蛋白原核表達工程菌用PBS溶解破碎后，經2次50%飽和度硫酸銨沉淀，用Brodford法分別測定不同稀釋度的原核表達菌破菌液中的蛋白含量，同時進行瓊脂雙向免疫擴散試驗(AGP)，48h觀察免疫沉淀線，以出現免疫沉淀線的表達產物最高稀釋倍數為該抗原的滴度，并由此探討豬圓環病毒2型衣殼蛋白(PCV2-CAP)原核表達產物中總蛋白含量與抗原滴度之間的相關關系。結果表明，AGP最小檢出值為0.255mg(蛋白)/ml，表達產物總蛋白含量在0.255～0.857mg/ml與以0.5為底的AGP滴度的對數成正相關關系(R2=0.9938)。當總蛋白含量超過0.857mg/ml時抗原滴度變化不再相關聯?？梢?， AGP能檢出表達產物中總蛋白的最低值為0.255mg/ml，最高值為0.857 mg/ml，在此區間內蛋白含量與AGP滴度成正相關關系，可以通過測定蛋白含量估算抗原滴度。

豬圓環病毒2型；蛋白含量；滴度；瓊脂雙向免疫擴散試驗

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)由Clark等于1997年從加拿大西部患有斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的豬群中分離得到。該病毒是一種致病性的DNA單鏈病毒，與豬皮炎、腎病綜合征、先天性震顫、后期流產和滲出性皮炎等疾病密切相關[1]，已對全球養豬業造成嚴重的經濟損失，因此對該病毒疫苗的研究具有極其重要的現實意義。疫苗制備過程中抗原含量的確定是保證免疫效果、防止疫苗本身副反應的關鍵環節，而采用免疫學方法進行抗原滴度的檢測需要較長的時間或專門的實驗設備和試劑，不便于及時掌握抗原的含量。為此，本研究采用Brodford法測量表達產物中蛋白含量，探討了蛋白含量與抗原滴度的相關性，以期采用蛋白含量估算抗原滴度，為疫苗配制過程中抗原量的調配提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

抗血清：由試驗豬免疫獲得；豬圓環病毒衣殼表達蛋白：經實驗誘導獲得；考馬斯亮藍G250；標準蛋白BSA 1mg/ml。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的制作

取18支試管分成6組編號，每組3個重復。將各組試管按表1依次加入不同濃度標準蛋白和G250混勻，放置5min后，在595nm波長下測定各管光密度。每組以3個重復的測定值的平均值作為該組蛋白的光密度。以蛋白濃度為橫坐標，以光密度為縱坐標繪制標準曲線[2-5]，得其標準曲線方程為y=1.1056x+0.5397(R2= 0.9902，圖1)。

表1 各試劑加入量與蛋白濃度

圖1 蛋白濃度與光密度的標準曲線

1.2.2硫酸銨粗純化蛋白液的配制

將收集到的原核表達豬圓環病毒衣殼蛋白(目的蛋白約含30%)用PBS按重量體積比1∶30溶解，加入固體硫酸銨，飽和度為50%，4℃放置1h，10000r/min離心30min，棄上清，蛋白沉淀用原體積PBS溶解，再次用50%硫酸銨沉淀，PBS復溶蛋白沉淀(純度約50%)。

1.2.3不同稀釋度蛋白液的光密度測定與蛋白濃度計算

采用Brodford法測量蛋白含量。先將硫酸銨粗純化蛋白液分別用PBS按照8∶2,6∶4,4∶6,2∶8,1∶9,1∶19的比例稀釋，分別記為：原稀釋度蛋白液、80%稀釋度蛋白液、60%稀釋度蛋白液、40%稀釋度蛋白液、20%稀釋度蛋白液、10%稀釋度蛋白液、5%稀釋度蛋白液，隨后分別測量其光密度值，并代入標準曲線方程，計算出各稀釋度蛋白液的蛋白濃度。

1.2.4不同稀釋度蛋白液的抗原滴度檢測

將上述各稀釋度蛋白液采用PBS等倍稀釋，分別從原倍稀釋至1/16后進行瓊脂擴散試驗[6-8]。其中周圍孔依次加滿等倍稀釋蛋白液和一個陰性對照，中間孔加滿抗血清，37℃溫育24～48h，觀察結果。

1.3 蛋白濃度與抗原滴度相關性分析

將上述不同稀釋度蛋白液的蛋白濃度與所測定的對應的抗原滴度結合，分析其相關性。

2 結果與分析

表2 不同稀釋度蛋白液的光密度與蛋白濃度

2.1 不同稀釋度蛋白液的蛋白濃度

將稀釋的蛋白液分別測定其光密度，求出平均值，依據標準曲線計算出蛋白濃度，結果見表2。

2.2 不同稀釋度蛋白液的抗原滴度

瓊脂擴散試驗結果見表3。由表3可知，原稀釋度蛋白和80%稀釋度蛋白的滴度相同，為1∶8，但前者沉淀線顏色較深(圖2-A、B)，反應更充分；10%稀釋度蛋白以后無沉淀線形成，蛋白濃度偏低。

表3 不同稀釋度蛋白液的抗原滴度

A.原稀釋度蛋白液；B.80%稀釋度蛋白液；C.60%稀釋度蛋白液；D.40%稀釋度蛋白液；E.20%稀釋度蛋白液

2.3 瓊脂擴散滴度與不同稀釋度的蛋白濃度相關性

綜合上述蛋白濃度與抗原滴度的數據來看，當蛋白濃度在0.255～0.857mg/ml范圍內，蛋白濃度每減少0.2mg/ml，其滴度降低1/2，高于0.857mg/ml抗原滴度上升不再明顯，低于0.255mg/ml則檢測不到抗原(表4)。

圖3 抗原滴度與蛋白濃度關系

表4不同稀釋度蛋白液的蛋白濃度與抗原滴度

抗原滴度蛋白濃度/(mg/ml)原稀釋度蛋白液1∶80 94480%稀釋度蛋白液1∶80 85760%稀釋度蛋白液1∶40 69140%稀釋度蛋白液1∶20 49220%稀釋度蛋白液1∶10 25510%稀釋度蛋白液-0 1245%稀釋度蛋白液-0 024

以蛋白濃度為橫坐標，以log0.5滴度為縱坐標作出折線圖(圖3)。由圖3可以看出，蛋白濃度在0.255～0.857mg/ml范圍時兩者成正相關，相關方程為y=4.9564x-1.3437(R2=0.9938)；含量超過0.857mg/ml后滴度達到上限。

3 討論與小結

為探討采用蛋白濃度估算抗原滴度的可行性，本研究采用Brodford法，通過測定不同稀釋度蛋白液的光密度求得其蛋白濃度，并通過瓊脂擴散試驗測定了不同稀釋度蛋白液的抗原滴度，分析了蛋白濃度與抗原滴度的相關性。結果表明，當蛋白濃度在0.255～0.857mg/ml范圍時，兩者成正相關，相關方程為y=4.9564x-1.3437(R2=0.9938)，相關性較好，可以以蛋白濃度估算抗原滴度。而當濃度達到0.857mg/ml時抗原滴度變化不再明顯，可能原因是抗原濃度過高，需要進一步稀釋。

瓊脂擴散試驗雖是一種操作簡單的抗體抗原檢測方法，當抗原和抗體呈特異性的結合且比例適當時，將會形成抗原抗體復合物的沉淀，在瓊脂中呈現一條不透明的白色沉淀線，但結果的判定也需要至24h才能得出，而Brodford法測定蛋白含量數分鐘就能測出，因此建立這種線性關系，即在同樣的血清條件下通過試驗得出抗原滴度與抗原蛋白的含量能夠快速預測抗原滴度，為疫苗及時準確配制提供了依據。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.04.010

Q939.91

A

1673-1409(2012)04-S037-04

2012-03-11

朱瑩瑩(1986-)，女，湖北武漢人，碩士生，研究方向為豬圓環病毒疫苗。

榮 俊，E-mailrongjun59626@gmail.com。