HBV前S基因芯片檢測研究

余 蓉，邱少紅，李傳珩，張 勤，簡維國 (石首市人民醫(yī)院檢驗科， 湖北 石首 434400)

HBV前S基因芯片檢測研究

余 蓉，邱少紅，李傳珩，張 勤，簡維國 (石首市人民醫(yī)院檢驗科， 湖北 石首 434400)

新發(fā)明的芯片法檢測前S基因缺失突變發(fā)現(xiàn)一個乙肝攜帶者體內(nèi)往往存在多種突變，傳統(tǒng)分析方法耗時耗力。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，單個PCR反應(yīng)產(chǎn)物足夠?qū)η癝基因缺失分型。個體基因克隆后的產(chǎn)物用于前S芯片法雜交檢測，比傳統(tǒng)DNA測序法省時經(jīng)濟。前S芯片為0.7cm2大小的尼龍膜，對于沒有測序儀器的臨床機構(gòu)來講更方便經(jīng)濟。同時，芯片自動檢測多種前S克隆，更適合于對慢性乙肝病毒攜帶者大范圍的突變掃描。雙盲法對比芯片法和傳統(tǒng)測序法，二者對前S突變的檢出率相近。

前S基因缺失突變；傳統(tǒng)基因序列檢測法；芯片法

慢性乙肝病毒感染是世界范圍內(nèi)原發(fā)性肝細胞癌發(fā)病的一個重要原因[1-6]，血液或體液為其主要傳播途徑。在癌癥發(fā)展之前乙肝病毒數(shù)十年的持續(xù)存在，多在40歲及以上病人發(fā)生乙肝相關(guān)原發(fā)性肝細胞癌[6-7]。慢性乙肝病毒攜帶者長期對病毒的控制可能對原發(fā)性肝癌的發(fā)生起到抑制作用。用于檢測慢性乙肝病毒攜帶者體內(nèi)病毒狀況的乙型肝炎病毒標記物包括DNA滴度、乙肝病毒表面抗原、核心抗原、以及e抗原[7-8]。標記物聯(lián)合檢測揭示了體內(nèi)病毒的復(fù)制情況以及宿主肝細胞內(nèi)病毒顆粒數(shù)量。乙肝病毒活動性復(fù)制以及高病毒滴度與乙肝病毒導(dǎo)致的肝臟病情如炎癥、纖維化、硬化和肝細胞癌的嚴重性相符[9]。

1 前S基因缺失突變而形成的大蛋白的發(fā)現(xiàn)

圖1 灰色部分標示前S1和前S2突變部位，圖上的箭頭指示HBV基因的起始位點

19世紀90年代末兩種類型的因前S基因缺失突變而形成的大蛋白被發(fā)現(xiàn)，并被認為與原發(fā)性肝細胞癌高度相關(guān)[10-11]。大蛋白主要表達在慢性乙肝病毒感染的后期，病毒基因組整合進入宿主染色體以后[12-15]。這種突變基因翻譯而成的大蛋白首先在毛玻璃樣肝細胞中被發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)證據(jù)提示其多出現(xiàn)在慢性乙肝病毒感染者及原發(fā)性肝細胞癌患者體內(nèi)[16]。前S突變形成的大蛋白與包括肝硬化和原發(fā)性肝癌在內(nèi)的嚴重肝臟疾病密切相關(guān)，可能原因是其參與了肝細胞癌變的發(fā)生發(fā)展過程[17-25]。前S基因突變包括前S1和前S2兩種不同的突變(見圖1)。突變基因翻譯而成的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，引發(fā)了劇烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力[26]，進而導(dǎo)致氧化毒性和DNA損傷[27]。同時存在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，突變的前S2蛋白能夠延長肝細胞壽命[28]。與原癌基因(c-jun)激活域結(jié)合蛋白1(JAB1)作用，誘導(dǎo)腫瘤抑制基因(p27kip1)降解，細胞周期進行，細胞增長[30]。因此認為在乙肝相關(guān)的肝細胞癌發(fā)生過程中前S突變很關(guān)鍵。

2 前S基因缺失掃描對慢性乙肝病毒攜帶者診治的重要性

圖2 前S基因芯片 7mm×10mm/w 包含42個核苷酸探針

圖3 A顯示野生型大蛋白基因；B顯示前S1突變蛋白基因，探針6、7信號陰性；C顯示前S2突變蛋白基因，信號12、13信號陰性

在發(fā)現(xiàn)前S突變以后，眾多相關(guān)研究結(jié)果報道了其在慢性乙肝病毒攜帶者體內(nèi)的廣泛存在[17-25]。突變的前S形成的大蛋白，尤其是前S2蛋白與包括肝癌在內(nèi)的乙肝相關(guān)疾病的嚴重性高度關(guān)聯(lián)。前S基因缺失突變掃描對于慢性乙肝病毒攜帶者診治尤其重要，同時與其他乙肝標志物聯(lián)合檢測以評估發(fā)生原發(fā)性肝癌的風(fēng)險。

慢性乙肝病毒攜帶者體內(nèi)前S基因突變的確認通常需要許多實驗步驟，因為突變的前S基因來源于野生的前S基因，一個攜帶者體內(nèi)可能存在許多前S自然突變，需要逐一克隆和測序，直接導(dǎo)致大樣本檢測的困難。新發(fā)明的檢測方法，省略傳統(tǒng)的DNA測序步驟，縮短程序使檢測時間由7d減少至3d。

DNA序列分析結(jié)果表明急性乙肝感染患者的前S基因突變率相對較低(為7％)，乙肝持續(xù)感染病程中前S基因缺失突變率逐漸上升至37％，在原發(fā)性肝癌患者中突變率升至60％，乙肝攜帶者基因組內(nèi)的前S突變易化了肝癌的發(fā)展。

前S基因芯片包含42個基因探針(見圖2)，檢測野生型大蛋白基因，前S1基因突變蛋白，前S2基因突變蛋白[27]。野生型能與芯片上所有探針雜交(見圖3A)，前S1突變顯示信號6、7探針缺失(見圖3B)，前S2突變顯示探針12、13缺失(見圖3C)。

3 前S基因芯片檢測的優(yōu)勢

傳統(tǒng)基因序列檢測法檢測前S1基因 21個克隆，前S1基因芯片分析檢測19個；前S1缺失突變檢出率傳統(tǒng)基因序列檢測法為70％，芯片法為65％。對比結(jié)果顯示芯片法可以提供敏感性分析。

新發(fā)明的芯片法檢測前S基因缺失突變發(fā)現(xiàn)一個乙肝攜帶者體內(nèi)往往存在多種突變，傳統(tǒng)分析方法耗時耗力。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，單個PCR反應(yīng)產(chǎn)物足夠?qū)η癝基因缺失分型。個體基因克隆后的產(chǎn)物用于前S芯片法雜交檢測，比傳統(tǒng)DNA測序法省時經(jīng)濟。前S芯片為0.7cm2大小的尼龍膜，對于沒有測序儀器的臨床機構(gòu)來講更方便經(jīng)濟。同時，芯片自動檢測多種前S克隆，更適合于對慢性乙肝病毒攜帶者大范圍的突變掃描。雙盲法對比芯片法和傳統(tǒng)測序法，二者對前S突變的檢出率相近。

研究結(jié)果表明急性乙肝感染HBV病毒高滴度，前S缺失突變率低；慢性乙肝感染后期，HBV病毒滴度小，前S缺失突變率較急性期明顯升高，至乙肝相關(guān)原發(fā)性肝癌階段，突變率甚至高至60％。提示前S缺失發(fā)生在HBV長期持續(xù)感染階段，最終成為乙肝病毒攜帶者。因此假設(shè)前S突變是肝臟癌變的重要因素，前S在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力增加以及氧化毒性，引起DNA損傷和突變[26-27]。有研究表明前S2突變引起細胞周期素A過表達，引發(fā)細胞周期開始，細胞增長[28-29]。結(jié)果表明，突變大蛋白尤其是前S2型參與了癌癥的發(fā)生過程。因此對于原發(fā)性肝癌的高危人群慢性乙肝攜帶者，檢測前S基因缺失突變很重要。

除外前S基因缺失，HBV一系列標志物例如HBV 滴度檢測、HbeAg也與慢性乙肝攜帶者罹患肝癌的風(fēng)險相關(guān)[30-31]。乙肝病毒復(fù)制引起肝臟損傷、炎癥，釋放腫瘤壞死因子，易化了纖維化的進程以及肝細胞的增殖[7-8]。HBV蛋白HBX能與許多宿主因子交互反應(yīng)，是病毒原癌蛋白[32-33]。HBX與細胞啟動子結(jié)合反應(yīng)，作用于反式調(diào)控元件[34]；同時調(diào)節(jié)蛋白酶體的功能，調(diào)控細胞降解以及病毒蛋白的合成[35]。因此假設(shè)前S突變加強了HBX的有害作用，引起細胞增殖和基因組的不穩(wěn)定性，從而易化了肝細胞癌的發(fā)生。

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[編輯] 何 勇

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.02.035

R349.6

A

1673-1409(2012)02-R073-04

2011-11-30

余蓉(1969-)，女，湖北監(jiān)利人，副主任檢驗技師，碩士，主要從事臨床免疫學(xué)及質(zhì)量控制工作。