高脂血癥性胰腺炎患者代謝組學研究

趙嚴 賈蓉蓉 胡國勇 王興鵬 邱云平 蘇明明 賈偉

高脂血癥性胰腺炎患者代謝組學研究

趙嚴 賈蓉蓉 胡國勇 王興鵬 邱云平 蘇明明 賈偉

核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance, NMR)、氣相色譜-飛行時間質譜(gas chromatography time-of-flight mass spectrometry, GC-TOF MS)等是當前代謝組學的主要分析手段。與核磁共振波譜相比，GC-TOF MS法兼具色譜的高分離效率和質譜的高分辨率，且擁有較完備的質譜數據庫用于代謝物鑒定,因而在代謝輪廓分析中日益受到重視。在我國，由于飲食結構的改變，高脂血癥性(主要是高三酰甘油)胰腺炎(hyperlipidemic pancreatitis，HLP)已經成為急性胰腺炎(AP)的常見病因之一[1]。本研究采用GC-TOF MS分析正常人、HLP患者血清代謝組特性，利用正交偏最小方差判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)法進行數據處理,辨識各組間代謝物質的差異。

一、材料與方法

1．研究對象：收集2006年10月至2009年3月山西醫科大學附屬第一醫院及上海交通大學醫學院附屬第一醫院收治的24例HLP患者。選擇與患者年齡、性別等相匹配的39例健康者作為對照。HLP診斷依據中華醫學會消化病學分會胰腺病學組制定的標準[2]：(1)具有AP臨床表現；(2)入院時(治療前)血三酰甘油(TG)≥11.3 mmol/L，或TG5.6～11.3 mmol/L且血清呈脂濁；(3)排除膽道疾患、酗酒、藥物、腫瘤、外傷等病因。

2．方法：入院24 h內采取血液標本，檢測血常規、血脂、電解質、腎功能、血氣分析、血糖、血鈣、肝功能、CRP等指標。同時留取一份血液，分離血清，置-80℃保存，待GC-TOF MS分析。

患者以及健康者均簽署知情同意書，詳細說明本研究的目的和方法。在樣本收集前一天要求食用清淡飲食，避免海鮮以及辛辣食物，并禁止采樣前一天喝酒與吸煙，以減少食物對代謝造成的波動。

3．GC-TOF MS：100 μl血清分別加入內標氯苯丙氨酸水溶液(0.3 mg/ml)和十七烷酸(1 mg/ml)溶液各10 μl,用甲醇∶氯仿(3∶1)300 μl提取代謝物，取上清300 μl真空濃縮干燥。干燥后用15 mg/ml吡啶溶劑的甲氧胺80 μl和80 μl N-O-雙(三甲硅基)氟乙酰胺[Bis(trimethylsilyl) trifluoroace-tamide, BSTFA)，含1% TMC]進行兩步反應，室溫下放置1 h后進樣分析。

氣相色譜-飛行時間質譜儀為美國Leco公司(Pegasus HT)產品，DB-5 ms氣相毛細管色譜柱購自安捷倫科技有限公司。MS分析條件：氣相升溫程序為80℃初溫2 min，以10℃/min的速率升至180℃，再以5℃/min的速率升至240℃，以25℃/min速率升至290℃，保留9 min。

4．統計學處理：采用Matlab軟件進行譜峰的判別和提取，將保留時間、質荷比和峰強度組成三維矩陣表，導入到SIMCA軟件進行多維統計分析。多維統計分析得到的差異變量通過商品化NIST化合物庫進行檢索，尋找匹配度、質譜圖等參考化合物。利用已建立好的標品庫對參考化合物進行驗證，從而確定所尋找的差異代謝物[3]。

二、結果

1．HLP患者血清的OPLS-DA分析：HLP患者血清的OPLS-DA模型區與健康者的OPLS-DA模型區能完全區分開(圖1)。

圖1 健康者(▼)及HLP患者(▲)的血清OPLS-DA圖

2．HLP患者與健康者血清代謝物質的差異： HLP患者與健康者血清的差異性代謝物質有4種，其中參與氨基酸代謝的丙氨酸(Alanine)、參與能量代謝的檸檬酸(Citrate)及延胡索酸(Fumaric acid)水平下降，參與脂肪酸代謝的十八烷酸(Octadecanoic acid)水平升高。

討論GC-TOF MS以其分辨率高、響應快、適于痕量分析等特點廣泛應用于食品安全、農藥殘留、藥物濫用和人體新陳代謝物質等分析領域。我們前期的代謝組學研究顯示，HLP患者和健康者尿樣的代謝圖譜完全不同[3]。尿樣有取樣方便，對人體完全無創的優點，但易受到飲食、飲水量以及腎臟功能等方面影響。為了更全面而又更加穩定地獲取HLP相關代謝通路的變化，本研究檢測血清代謝組學，并與尿樣中得到結果進行相互驗證和補充。

本研究結果顯示，HLP患者血清丙氨酸、檸檬酸、延胡索酸等代謝物水平顯著低于健康者，而十八烷酸顯著高于健康者，與前期尿液中差異代謝物的結果一致[3]。Bohus等[4]亦報道，以L-精氨酸誘導SD大鼠胰腺炎模型后，與三羧酸循環相關的中間代謝產物如：檸檬酸、a-同戊二酸、琥珀酸、延胡索酸等水平下降。檸檬酸和延胡索酸作為三羧酸循環中的主要中間代謝物質，它們的下降可能預示著HLP患者能量代謝中有氧呼吸的下調,表明有氧呼吸能量代謝的降低與HLP的關系密切。三羧酸循環發生于細胞的線粒體中，因此三羧酸循環底物的改變與機體的線粒體功能改變相關。王艷蕾等[5]在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠模型證實，胰腺細胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性下降。因此維持線粒體功能，減輕胰腺亞細胞器功能的損害，可以改善HLP患者的預后。

三酰甘油的代謝產物游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)可引起或加重AP病情。本研究發現，HLP患者血清中多種飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸，如十八烷酸、二十烷酸、棕櫚酸等水平升高。楊佳芳等[6]曾報道，高三酰甘油血癥能引起ANP大鼠與脂質代謝相關的基因，如脂肪酸易位酶、脂肪酸結合蛋白、脂質代謝酶等表達下調，導致脂質代謝異常。但這些代謝物的生化意義還有待于進一步研究。

[1] 黃開紅,林萍,聶勝利,等.廣東地區1316例急性胰腺炎的臨床流行病學特征.中華內科雜志,2007,46:831-834.

[2] 中華醫學會消化病學分會胰腺病學組.中國急性胰腺炎診治指南.中華消化雜志,2004,24:190-192.

[3] 趙嚴,吳建兵,潘立,等.高脂血癥性胰腺炎患者尿樣的代謝組學.中華胰腺病雜志,2009,9:85-88.

[4] Bohus E,Coen M,Keun HC,et al.Temporal metabonomic modeling of L-arginine-induced exocrine pancreatitis.J Proteome Res,2008,7:4435-4445.

[5] 王艷蕾,賈玉杰,姜妙娜,等.梔子對重癥急性胰腺炎胰腺細胞結構和功能的影響及其與內毒素氧自由基的關系.陜西醫學雜志,2007,36:22-24.

[6] 楊佳芳,王興鵬,吳愷.高脂血癥引起急性胰腺炎大鼠基因表達變化.中華消化雜志，2007,5:322-325.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.016

國家自然科學基金(30971359)；國家863計劃(2009AA02Z116)

200072 上海，同濟大學附屬第十人民醫院 上海市第十人民醫院消化內科(趙嚴、賈蓉蓉、胡國勇、王興鵬)；上海交通大學藥學院(邱云平、蘇明明、賈偉)

王興鵬，Email:wangxp1965@yahoo.com.cn

2012-02-14)

(本文編輯：屠振興)