胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

吳健婷 田字彬 丁雪麗 荊雪 江月萍 魏良洲 孔心涓 張翠萍 趙清喜

·論著·

胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

吳健婷 田字彬 丁雪麗 荊雪 江月萍 魏良洲 孔心涓 張翠萍 趙清喜

目的檢測胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白標(biāo)志物，并建立診斷模型。方法應(yīng)用表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測17例胰腺癌相關(guān)糖尿病與17例新發(fā)2型糖尿病、17例健康對照者血清的差異表達蛋白，用Biomarker Patterns Software 5.0軟件建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型并驗證。結(jié)果在胰腺癌相關(guān)糖尿病、新發(fā)2型糖尿病、健康者各10例的蛋白指紋圖譜中篩選出12個差異表達蛋白峰，其中質(zhì)荷比為6116、6695、8936 Da的蛋白峰被選為建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型的蛋白峰。該診斷模型的診斷正確率為90%。盲法驗證各組另7例樣本，正確診斷胰腺癌相關(guān)糖尿病患者達100%，新發(fā)2型糖尿病患者為71%，健康人群為86%。經(jīng)檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，與以上3種差異表達蛋白分子質(zhì)量最為接近的蛋白分別為金屬硫蛋白、胰腺干細胞增殖分化因子和成纖維細胞生長因子1。結(jié)論通過SELDI方法篩選出3種胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白標(biāo)志物，建立了可靠的胰腺癌相關(guān)糖尿病的診斷模型。

糖尿病； 胰腺腫瘤； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)

有學(xué)者[1-3]認為，新發(fā)糖尿病(病程≤2年)是胰腺癌的早期臨床表現(xiàn)，可將新發(fā)糖尿病患者作為篩查胰腺癌的高危人群。但新發(fā)糖尿病中，多數(shù)為新發(fā)的2型糖尿病，只有較少部分由胰腺癌引起，稱為胰腺癌相關(guān)糖尿病。若在新發(fā)糖尿病患者中篩查出胰腺癌相關(guān)糖尿病，則有可能實現(xiàn)胰腺癌的早期診斷。本研究比較胰腺癌相關(guān)糖尿病患者與相應(yīng)對照患者的血清蛋白質(zhì)譜差異，篩選胰腺癌相關(guān)糖尿病的血清蛋白標(biāo)志物，以期為胰腺癌相關(guān)糖尿病的鑒別診斷和發(fā)病機制的探討提供依據(jù)。

材料與方法

一、臨床資料

2011年5月至2011年12月間采集青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的17例胰腺癌相關(guān)糖尿病、17例不合并糖尿病的胰腺癌、5例胰腺癌合并長期糖尿病、17例新發(fā)2型糖尿病患者及17例在體檢中心體檢的健康者全血標(biāo)本5 ml，立即放入4℃冰箱靜置3 h，4℃離心取血清，按每管50 μl分裝后置-80℃冰箱保存。胰腺癌相關(guān)糖尿病組與其他各組患者的年齡、性別相匹配。胰腺癌診斷均經(jīng)病理檢查證實。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參見1997年美國糖尿病協(xié)會推薦的標(biāo)準(zhǔn)[4]。胰腺癌相關(guān)糖尿病：胰腺癌合并病程≤2年的糖尿病。新發(fā)2型糖尿病：病程≤2年的2型糖尿病，且除外胰腺癌可能。長期糖尿病：病程>5年的2型糖尿病，且除外胰腺癌可能。

二、血清蛋白指紋圖譜檢測

采用表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測。具體操作：將血清冰浴融化后置4℃ 10 000 r/min離心2 min，取血清10 μl，加入20 μl U9緩沖液(9 mol/L尿素、20 g/L CHAPS、10 g/L DTT、50 mmol/L Tris-HCL，pH9.0)，充分混勻振蕩30 min，加入50 mmol/L NaAc(pH4.0)370 μl，混勻。取50 g/L的弱陽離子WCX型納米磁珠(北京賽爾迪生物技術(shù)有限公司)50 μl，加入PCR管中，加入100 μl NaAc混勻、活化5 min后于磁性分離板上放置2 min，棄上清液，重復(fù)上述操作1次。

每份棄上清液活化的磁珠中加入100 μl處理好的血清樣本，充分振蕩混勻，室溫孵育30 min，磁性分離板上放置1 min，棄上清液。用100 μl NaAc洗脫2次，每次5 min，加入10 μl TFA洗脫結(jié)合在磁珠上的血清蛋白。5 min后取5 μl蛋白洗脫液，加入5 μl SPA，充分混勻后吸取2 μl混合液點樣于金芯片(Au Chip)，自然晾干。

應(yīng)用PBSⅡ-C蛋白質(zhì)芯片時間飛行質(zhì)譜儀(美國Ciphergen公司)檢測血清蛋白。設(shè)定最高檢測分子質(zhì)量為50 000，優(yōu)化范圍為1500～20 000，激光強度為260，檢測敏感度為8。濾去分子質(zhì)量10 000以下的峰，以免基質(zhì)峰對結(jié)果造成干擾。檢測前用All-in-one多肽標(biāo)準(zhǔn)芯片校正儀器，系統(tǒng)質(zhì)量偏差≤0.1%。

三、胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型建立

采用Biomarker Patterns Software5.0識別診斷胰腺癌相關(guān)性糖尿病的最佳標(biāo)志物，建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型。對建立診斷模型的差異蛋白峰進行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索(http://us.expasy.org/tools/tagident.html)，以尋找與其分子質(zhì)量最為接近的蛋白質(zhì)。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用Ciphergen proteinchip3.1分析軟件自動采集數(shù)據(jù)，不同組之間蛋白峰峰值的差異采用Biomarker Wizard行t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰腺癌相關(guān)糖尿病組與其他各組的蛋白指紋圖譜的比較

胰腺癌相關(guān)糖尿病組與胰腺癌合并長期糖尿病組、胰腺癌不合并糖尿病組、新發(fā)2型糖尿病組、健康對照組的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜見圖1。胰腺癌相關(guān)糖尿病組的質(zhì)荷比為8455 Da的蛋白峰表達顯著高于其他各組(P<0.05)。

1、2：胰腺癌相關(guān)糖尿病；3、4：胰腺癌不合并糖尿病；5：胰腺癌合并長期糖尿病；6、7：新發(fā)糖尿病；8、9：健康對照

圖1胰腺癌相關(guān)糖尿病組與其他各組的蛋白指紋圖譜

二、胰腺癌相關(guān)糖尿病組與新發(fā)2型糖尿病組、健康對照組的比較

按數(shù)字表法在胰腺癌相關(guān)糖尿病組、新發(fā)2型糖尿病組、健康對照組中各選取10例組成建模組，發(fā)現(xiàn)12個蛋白峰峰值的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)，其中質(zhì)荷比為6116、6695、8936 Da的蛋白峰被選為建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型的蛋白峰。各組質(zhì)荷比為6116 Da的蛋白峰見圖2。

質(zhì)荷比(M/Z)胰腺癌相關(guān)糖尿病新發(fā)2型糖尿病健康對照P值6116a3.23±1.6532.00±1.236.45±2.620.00085591218.39±17.2215.34±13.4158.50±27.890.001076695a1.99±0.990.90±0.301.76±0.770.0040281367.47±5.8011.15±12.903.10±1.330.007248936a10.83±5.668.44±5.614.70±2.840.0081916819.75±5.196.24±3.1313.14±5.420.0103729583.25±3.203.17±3.258.10±4.530.0128855500.86±0.820.60±0.311.63±0.810.01413332940.30±0.120.41±0.310.76±0.490.0206565011.51±1.310.93±0.342.07±1.040.0318617422.18±1.411.73±1.774.42±3.520.04444116684.58±2.485.91±3.492.85±1.920.04692

注：a被選為建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型的蛋白峰

1、2：胰腺癌相關(guān)糖尿病；3、4：新發(fā)2型糖尿病；5、6：健康對照

三、胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型流程

以6116 Da蛋白為節(jié)點 1，將30例中峰值>5.94的7例劃分到終節(jié)點4中，為健康人群；峰值≤5.94的23例樣本再以6695 Da蛋白為節(jié)點2繼續(xù)劃分，峰值≤1.24的11例劃分到終節(jié)點1中，診斷為新發(fā)2型糖尿病；峰值>1.24的12例以8936 Da蛋白為節(jié)點3繼續(xù)劃分，峰值≤3.52的2例劃分到終節(jié)點2中，為健康人群，峰值>3.52的10例劃分到終節(jié)點3中，診斷為胰腺癌相關(guān)糖尿病(圖3)。其診斷ROC曲線見圖4。

紅色條為健康對照，藍色條為新發(fā)糖尿病，綠色條為胰腺癌相關(guān)糖尿病

圖3胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型圖

圖4 胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型ROC曲線

四、診斷模型的盲法驗證

采用已建立的診斷模型對建模組30例及另21例蛋白指紋圖譜進行盲法驗證，結(jié)果顯示建模組30例的診斷正確率均達90%，另21例中胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷率為100%，新發(fā)糖尿病診斷準(zhǔn)確率為71%，健康人群為86%(表2)。

表2 診斷模型的盲法驗證結(jié)果

五、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢

對建立胰腺癌相關(guān)糖尿病診斷模型的3個差異蛋白峰分別進行數(shù)據(jù)庫檢索，6116 Da蛋白與金屬硫蛋白(6115 Da)的分子質(zhì)量最為接近，8936 Da蛋白與胰腺干細胞增殖分化因子(8933 Da)的分子質(zhì)量最為接近，6695 Da蛋白與成纖維細胞生長因子1(FGF1，6698 Da)的分子質(zhì)量最為接近。

討 論

胰腺癌的早期診斷一直是臨床工作中亟待解決的問題，目前常用的胰腺癌血清學(xué)標(biāo)志物因其靈敏性和特異性欠佳，不能滿足早期診斷胰腺癌的需要。近年來，以新發(fā)糖尿病為胰腺癌高危人群，從中篩查胰腺癌相關(guān)糖尿病為胰腺癌的早期診斷提供了新的思路。目前關(guān)于胰腺癌相關(guān)糖尿病發(fā)病機制主要是胰腺癌釋放的可溶性介質(zhì)干預(yù)胰島β細胞功能，影響肝臟、肌肉的糖代謝過程，引起胰島素抵抗，最終導(dǎo)致胰腺癌相關(guān)糖尿病的發(fā)生[5]。對于可溶性介質(zhì)的研究主要集中在體外細胞培養(yǎng)、組織標(biāo)本檢測、基因組學(xué)研究等方面。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)得到迅速發(fā)展。SELDI是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)之一，在腫瘤標(biāo)志物的探索方面得到廣泛應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌相關(guān)糖尿病組與新發(fā)2型糖尿病組、健康對照組間有12個蛋白峰峰值存在統(tǒng)計學(xué)差異，其中6116、8936和6695 Da的蛋白峰為診斷胰腺癌相關(guān)糖尿病的最佳標(biāo)志物。以此為依據(jù)建立的診斷模型診斷正確率為90%。盲法驗證顯示，該模型可正確劃分100%的胰腺癌相關(guān)糖尿病患者、71%的新發(fā)糖尿病患者和86%的健康人群。本研究還顯示，質(zhì)荷比為8455 Da的蛋白峰在胰腺癌相關(guān)糖尿病組與其他組的差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義，但在建模組間未發(fā)現(xiàn)顯著差異，其原因有待進一步擴充樣本量后驗證。

6116 Da蛋白峰與金屬硫蛋白分子質(zhì)量最為接近。研究發(fā)現(xiàn)，金屬硫蛋白具有清除自由基、減輕高血糖及脂肪酸的細胞毒性、改善胰島素抵抗從而延緩糖尿病發(fā)生的作用[6]。8936 Da蛋白峰與胰腺干細胞增殖分化因子與的分子質(zhì)量最為接近。6695 Da蛋白與FGF1蛋白的分子質(zhì)量最為接近，F(xiàn)GF1可改善胰島β細胞功能，促進胰島素分泌，促進脂肪合成[7]。本實驗顯示，胰腺癌相關(guān)糖尿病患者血清6116 Da、6695 Da蛋白表達下調(diào)，8936 Da蛋白表達上調(diào)，它們參與胰腺癌相關(guān)糖尿病的發(fā)病機制尚待進一步研究。

由于本實驗采用SELDI技術(shù)，它所得到的每一個波峰值對應(yīng)的可能是多個分子質(zhì)量相近的蛋白質(zhì)或多肽，因此，并不能對目標(biāo)蛋白做直接鑒定，依據(jù)其分子質(zhì)量在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索所得結(jié)果只是一種可能性猜測，因此對所篩選到的差異表達蛋白尚需進一步明確。

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Serumproteomicanalysisofpancreaticcancerassociateddiabetes

WUJian-ting,TIANZi-bin,DINGXue-li,JINGXue,JIANGYue-ping,WEILiang-zhou,KONGXin-juan,ZHANGCui-ping,ZHAOQing-xi.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266003,China

TIANZi-bin,Email:tianzb@qdumh.qd.sd.cn

ObjectiveTo detect serum biomarkers for pancreatic cancer associated diabetes and establish a model for diagnosis.MethodsSELDI-TOF-MS was used to detect the differentially expressed serum proteins from 17 pancreatic cancer associated diabetes patients, 17 new-onset type Ⅱ diabetes patients and 17 healthy controls, then a model of biomarkers was constructed and validated by Biomarker Patterns Software 5.0.ResultsTwelve discriminating m/z peaks were identified in the protein fingerprints in 10 pancreatic cancer associated diabetes patients, 10 new-onset type Ⅱ diabetes patients and 10 healthy controls. Among them, the three biomarkers of mass/charge ratio 6116, 6695 and 8936 were used to construct the model, which could diagnose 90% pancreatic cancer associated diabetes form control groups. Blind test of other 7 samples of three groups showed that 100% pancreatic cancer associated diabetes, 71% new-onset diabetes and 86% healthy controls were correctly classified. After searching protein database, there were metallothionein, pancreatic progenitor cell differentiation and proliferation factor-like protein, and fibroblastic growth factor 1, which were close to the weights of the above mentioned 3 differentially expressed proteins.ConclusionsSELDI can identify 3 biomarkers for pancreatic cancer associated diabetes and a reliable model for diagnosis of pancreatic cancer associated diabetes is established.

Diabetes mellitus; Pancreatic neoplasms; Proteomics; SELDI-TOF-MS

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.005

266003 青島，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

田字彬，Email:tianzb@qdumh.qd.sd.cn

2012-05-23)

(本文編輯：呂芳萍)