姜黃素通過(guò)抑制Ras-ERK和Shh-GLI1信號(hào)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡*

孫曉東, 劉杏娥

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院普外科， 浙江 杭州 310016； 2浙江醫(yī)院腫瘤科， 浙江 杭州 310013)

1000-4718(2012)06-0996-05

2011-12-19

2012-03-22

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.Y2100434)

△通訊作者 Tel: 0571-87987373;E-mail: xingel@sohu.com

姜黃素通過(guò)抑制Ras-ERK和Shh-GLI1信號(hào)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡*

孫曉東1, 劉杏娥2△

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院普外科， 浙江 杭州 310016；2浙江醫(yī)院腫瘤科， 浙江 杭州 310013)

目的探討姜黃素對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。方法不同濃度的姜黃素作用于PANC-1細(xì)胞后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blotting檢測(cè)K-Ras、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-ERK1/2)、Sonic hedgehog(Shh)和膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同系物1(GLI1)的表達(dá)水平。結(jié)果不同濃度的姜黃素與PANC-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，濃度為30 mmol/L的姜黃素組能明顯抑制PANC-1細(xì)胞的增殖, 與其余各組相比，差異顯著(P<0.01)。PANC-1細(xì)胞經(jīng)30 mmol/L姜黃素處理后，其細(xì)胞凋亡率(37.57%)明顯高于對(duì)照組(4.62%)(P<0.01)。經(jīng)姜黃素處理的PANC-1細(xì)胞，其K-Ras、p-ERK、Shh和GLI1表達(dá)明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)。結(jié)論姜黃素通過(guò)抑制Ras-ERK和Shh-GLI1信號(hào)通路的活化，抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

姜黃素； 胰腺腫瘤； Hedgehog; Ras-ERK通路; Shh-GLI1通路

姜黃素(curcumin)是一種從姜科植物姜黃中提取的酚化合物，具有強(qiáng)烈的抗炎、抗氧化、抗突變等特性[1]。近年來(lái)的研究表明，姜黃素可通過(guò)多種機(jī)制抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)凋亡，并能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性[2-3]。

胰腺癌細(xì)胞中K-ras基因的突變率可達(dá)70%～100%，提示K-Ras信號(hào)在胰腺癌的起始、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用[4]。Hedgehog(Hh)信號(hào)通路的異常激活在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中也起重要作用[5-6]。我們通過(guò)研究姜黃素對(duì)胰腺癌細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞凋亡等影響，同時(shí)檢測(cè)K-Ras、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)、Sonic hedgehog(Shh)和膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同系物1(glioma-associated oncogene homolog 1,GLI1)蛋白表達(dá)水平，探討姜黃素對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用及可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞株及主要試劑

PANC-1(K-ras突變)胰腺癌細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。姜黃素為Sigma產(chǎn)品。兔抗人K-Ras、ERK1/2、p-ERK1/2、Shh和GLI1 Ⅰ抗為Cell Signaling產(chǎn)品，鼠抗兔Ⅱ抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。DMEM、胎牛血清為Gibco產(chǎn)品。MTT為Sigma產(chǎn)品。

2方法

2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 胰腺癌細(xì)胞經(jīng)DMEM常規(guī)培養(yǎng)后用0.25%胰酶消化, 以1×107/L接種于96 孔培養(yǎng)板中，37 ℃過(guò)夜。將細(xì)胞分對(duì)照組和姜黃素處理組(10 mmol/L、20 mmol/L和30 mmol/L)，培養(yǎng)48 h后將96孔板中的細(xì)胞以500×g離心3 min，棄100 μL上清液，加MTT 10 μL(5 g/L)，37 ℃ 孵育4 h，加DMSO 100 μL，振蕩10 min后上酶標(biāo)免疫測(cè)定儀檢測(cè)A490值。細(xì)胞增殖抑制率(%)= (1-處理組A/對(duì)照組A)×100%。

2.2采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)姜黃素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn) 按試劑盒說(shuō)明書操作，PANC-1細(xì)胞經(jīng)DMEM常規(guī)培養(yǎng)后用0.25%胰酶消化, 以1×108/L接種于6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過(guò)夜，將細(xì)胞分為對(duì)照組和姜黃素處理組(10 mmol/L、20 mmol/L和30 mmol/L )。經(jīng)48 h處理后胰酶消化收集細(xì)胞，經(jīng)800×g、離心5 min，再經(jīng)PBS洗3次，分別加緩沖液50 μL、V-FITC 5 μL和PI 10 μL，避光5 min以上，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.3姜黃素對(duì)ERK1/2磷酸化的影響 應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2表達(dá)水平。PANC-1細(xì)胞經(jīng)DMEM常規(guī)培養(yǎng)，用0.25%胰酶消化后, 以1×108/L接種于6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過(guò)夜，將細(xì)胞分對(duì)照組和姜黃素30 mmol/L處理組，48 h后收集各組細(xì)胞，一步法裂解細(xì)胞，13 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量。常規(guī)制備10%SDS-PAGE分離膠和積層膠。每孔上樣蛋白量50 μg，加4×上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min，上樣后100 V電泳至染料跑出膠。輕輕取下膠，用Millipore H2O洗膠1次，100 V轉(zhuǎn)膜2 h，用封閉液37 ℃封閉2 h，加入相應(yīng)的Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜4次，每次10 min，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫1 h，TBST洗膜4次，每次10 min，最后加ECL液曝光顯色。結(jié)果用Band Leader軟件進(jìn)行條帶灰度半定量分析。

2.4姜黃素對(duì)Shh和GLI1表達(dá)的影響 應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)Shh和GLI1的表達(dá)水平。同方法2.3，結(jié)果用Band Leader軟件進(jìn)行條帶灰度半定量分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1MTT檢測(cè)增殖結(jié)果

隨著姜黃素濃度的逐漸增加，PANC-1細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增加，10 mmol/L姜黃素處理組與對(duì)照組相比，PANC-1細(xì)胞的增殖明顯被抑制，差異顯著(P<0.01)；20 mmol/L姜黃素處理組與10 mmol/L姜黃素處理組相比，PANC-1細(xì)胞的增殖抑制差異不顯著(P>0.05),與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖明顯被抑制，差異顯著(P<0.01)；30 mmol/L姜黃素處理組與20 mmol/L姜黃素處理組相比，PANC-1細(xì)胞的增殖明顯被抑制，差異顯著(P<0.01)，與10 mmol/L姜黃素處理組相比，細(xì)胞增殖明顯被抑制，差異顯著(P<0.01)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖抑制率明顯增高，差異顯著(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1PANC-1細(xì)胞增殖抑制率

GroupGrowthinhibioryrateControl0Curcumin(10mmol/L)12.58±3.52**Curcumin(20mmol/L)15.43±3.63**##Curcumin(30mmol/L)60.21±6.83**##△△

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs10 mmol/L curcumin group；△△P<0.01vs20 mmol/L curcumin group.

2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)姜黃素誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡的結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。10 mmol/L姜黃素處理組與對(duì)照組相比，PANC-1細(xì)胞的凋亡率明顯增高，差異顯著(P<0.01)；20 mmol/L姜黃素處理組與10 mmol/L姜黃素處理組相比，凋亡率無(wú)顯著差異(P>0.05)，與對(duì)照組相比，凋亡率明顯增高，差異顯著(P<0.01)；30 mmol/L姜黃素處理組與20 mmol/L姜黃素處理組相比，PANC-1細(xì)胞的凋亡率明顯增高，差異顯著(P<0.01)，與10 mmol/L姜黃素處理組相比，凋亡率明顯增高，差異顯著(P<0.01)，與對(duì)照組相比，凋亡率也明顯增高，差異顯著(P<0.01)。

Figure 1. Apoptosis of PANC-1 cells detected by flow cytometry.A: control group;B:curcumin treatment group(30 mmol/L).

圖1PANC-1細(xì)胞的凋亡

表2PANC-1細(xì)胞凋亡率

GroupApoptoticrateControl4.26±0.26Curcumin(10mmol/L)7.97±0.55**Curcumin(20mmol/L)8.48±0.55**##Curcumin(30mmol/L)37.57±1.46**##△△

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs10 mmol/L curcumin group；△△P<0.01vs20 mmol/L curcumin group.

3姜黃素抑制PANC-1細(xì)胞K-Ras的表達(dá)及ERK1/2磷酸化水平

與對(duì)照組相比，K-Ras在姜黃素組中的表達(dá)明顯降低，差異顯著(P<0.05)；與對(duì)照組相比，ERK1/2在姜黃素組中的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；與對(duì)照組相比，p-ERK1/2在姜黃素組中的表達(dá)明顯降低，差異顯著(P<0.01)。這些結(jié)果提示姜黃素可抑制PANC-1細(xì)胞K-Ras及其下游信號(hào)分子的活化，見(jiàn)圖2。

圖2Westernblotting檢測(cè)K-Ras、ERK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)

4姜黃素抑制PANC-1細(xì)胞Shh和GLI1的表達(dá)

與對(duì)照組相比，Shh在姜黃素組中的表達(dá)明顯降低，差異顯著(P<0.01)；與對(duì)照組相比，GLI1在姜黃素組中的表達(dá)明顯降低，差異顯著(P<0.01)。這些結(jié)果提示姜黃素可抑制Hedgehog信號(hào)通路，見(jiàn)圖3。

圖3Westernblotting檢測(cè)Shh和GLI1的表達(dá)

討 論

多條信號(hào)通路的異常和持續(xù)活化是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)、耐藥等的主要機(jī)制[7-8]。研究表明，姜黃素因具有抗炎、抗HIV-1、抗肺纖維化、預(yù)防腫瘤、抑制腫瘤、放化療增敏等多種藥理活性作用，近年來(lái)在腫瘤領(lǐng)域受到極大關(guān)注。姜黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞，包括乳腺癌、胃癌、大腸癌、肺癌、胰腺癌等均具有化學(xué)預(yù)防及治療作用[7，9]。姜黃素抗腫瘤作用的機(jī)制主要是通過(guò)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路分子，如下調(diào)EGFR、HER-2、Shh/GLI1、Wnt/β-catenin及其下游信號(hào)分子ERK、Akt、NF-κB、STATs等，上調(diào)p21、p27、細(xì)胞周期激酶抑制劑等[8，10-12]。

在胰腺癌中，姜黃素具有抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抗血管生成、化療增敏等作用，其機(jī)制尚未完全清楚，可能與姜黃素能抑制EGFR、STAT-3、NF-κB及其下游靶基因——多藥耐藥相關(guān)蛋白5表達(dá)等有關(guān)[13-16]。姜黃素通過(guò)下調(diào)NF-κB依賴基因和Sp1、Sp2、Sp3轉(zhuǎn)錄因子抑制Panc28和L3.6pL胰腺癌細(xì)胞增殖[13]。姜黃素腹腔內(nèi)注射能抑制裸鼠L3.6pL胰腺癌細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)[15]。姜黃素還能提高吉西他濱對(duì)BxPC-3、Panc-1和Miapaca-2胰腺癌細(xì)胞的抗增殖及誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)[13，16]。在胰腺癌動(dòng)物模型中，姜黃素和吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用比吉西他濱單藥更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)及抗血管生成[13，16]。姜黃素的化療增敏作用部分是通過(guò)抑制STAT-3和NF-κB調(diào)節(jié)基因如cyclins、c-myc、bcl-2、bcl-XL、MMPs、VEGF等的表達(dá)[13，16]。

在所有惡性腫瘤中，胰腺癌的K-ras基因突變率最高，可達(dá)70%～100%。K-ras基因突變后，轉(zhuǎn)為癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物Ras 蛋白發(fā)生構(gòu)型改變，功能也隨之改變，不需外界生長(zhǎng)信號(hào)的刺激便自身活化，主要通過(guò)Ras-Raf- MEK - ERK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等。K-ras基因突變是胰腺癌發(fā)生過(guò)程中的早期分子事件，在胰腺癌的起始、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的作用[3]。

Hh信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要由信號(hào)分子Shh、膜受體Patched(Ptch)、Smoothened (Smo)和下游的核轉(zhuǎn)錄因子GLI組成(即Shh-Ptch-Smo-GLI)。GLI的靶基因涉及到腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、新生血管形成等多個(gè)方面[17]。近年來(lái)的研究表明，Hh/GLI信號(hào)通路的異常激活在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中起重要作用[4-5]。

而有關(guān)Hh和Ras- Raf-MEK-ERK信號(hào)通路之間串聯(lián)對(duì)話的報(bào)道很少。研究發(fā)現(xiàn)，在Hh/GLI信號(hào)介導(dǎo)的腫瘤發(fā)展過(guò)程中，其它癌基因產(chǎn)物(如突變的K-Ras)以及Hh與不同生長(zhǎng)因子，包括酪氨酸激酶受體[如表皮生長(zhǎng)受體EGFR、Wnt/β-catenin和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)/TGF-β受體]之間的串聯(lián)對(duì)話同樣起著重要作用[18]。Morton等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)，Hh信號(hào)通路與活化的K-Ras具有協(xié)同作用，Hh通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞對(duì)MAPK和PI3-K/Akt/mTOR信號(hào)持續(xù)活化的依賴，從而增強(qiáng)K-Ras誘導(dǎo)的胰腺癌發(fā)生、發(fā)展。但也有研究表明，在胰腺導(dǎo)管腺癌中，Hh信號(hào)通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子GLI1可不依賴于上游Shh-Ptch-Smo的信號(hào)，而受TGF-β和K-Ras信號(hào)的調(diào)控[20]。

我們研究姜黃素對(duì)PANC-1細(xì)胞(K-ras基因突變)的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的姜黃素與PANC-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，隨著姜黃素濃度的逐漸增加，PANC-1細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增加，濃度為30 mmol/L的姜黃素能明顯抑制PANC-1細(xì)胞的增殖。PANC-1細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理后，細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，提示姜黃素能在體外誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能顯著抑制PANC-1細(xì)胞K-Ras的表達(dá)和ERK1/2的磷酸化水平。而ERK1/2是K-Ras下游主要的信號(hào)分子之一，結(jié)果提示姜黃素能抑制K-Ras及其下游信號(hào)分子的活化。我們同時(shí)還檢測(cè)了Shh和GLI1的表達(dá)水平。經(jīng)姜黃素處理后，PANC-1細(xì)胞Shh和GLI1的表達(dá)水平均明顯下降。GLI1蛋白是Smo下游的轉(zhuǎn)錄因子，在Hh通路中起關(guān)鍵作用。GLI1也是Hh信號(hào)活化后的靶基因，GLI1表達(dá)下降，提示Hh信號(hào)通路被抑制。

綜上所述，姜黃素能抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1的體外增殖，并可能通過(guò)抑制細(xì)胞K-Ras下游信號(hào)分子ERK1/2的磷酸化和Hedgehog信號(hào)通路信號(hào)分子Shh、GLI1的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞的凋亡。

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CurcumininducesapoptosisofpancreaticcancercellsbyinhibitingRas-ERKandShh-GLI1signalpathways

SUN Xiao-dong1, LIU Xing-e2

(1DepartmentofGeneralSurgery,SirRunRunShawHospitalAffiliatedtoZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310016,China;2DepartmentofOncology,ZhejiangHospital,Hangzhou310013,China.E-mail:xingel@sohu.com)

AIM: To investigate the effects of curcumin on pancreatic cancer cells and the possible molecular mechanisms.METHODSThe pancreatic cancer PANC-1 cells were treated with curcumin. Growth inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay. Apoptosis of the cells was detected by flow cytometry. The expression levels of K-Ras,extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2),phosphorylated ERK1/2(p-ERK1/2),Sonic hedgehog (Shh) and glioma-associated oncogene homolog 1(GLI1) were determined by Western blotting.RESULTSThe growth inhibitory rate of the cells in 30 mmol/L curcumin group was significantly different from that in other groups. Apoptotic rate in 30 mmol/L curcumin group (37.57%) was significantly higher than that in control group (4.62%). The expression levels of K-Ras, p-ERK1/2, Shh and GLI1 in curcumin groups were significantly lower than those in control group.CONCLUSIONCurcumin inhibits proliferation and induces apoptosis of pancreatic cancer cells by inhibiting Ras-ERK and Shh-GLI1 signal pathways.

Curcumin; Pancreatic neoplasms; Hedgehog; Ras-ERK pathway; Shh-GLI1 pathway

R735.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.06.007