反復細菌感染致大鼠氣道重構中結締組織生長因子的表達變化及意義*

文 文， 賴國祥△， 柳德靈， 張亞彬， 姚麗青, 王愛民

(安徽醫科大學福州總院教學醫院 1呼吸與危重癥醫學科，2檢驗科，3病理科，福建 福州 350025)

1000-4718(2012)03-0546-04

2011-09-05

2011-12-12

福建省自然科學基金資助項目(No.Z0516077)

△通訊作者 Tel：0591-22859333；E-mail: laiguoxiang2007@163. com

反復細菌感染致大鼠氣道重構中結締組織生長因子的表達變化及意義*

文 文1， 賴國祥1△， 柳德靈1， 張亞彬2， 姚麗青3, 王愛民1

(安徽醫科大學福州總院教學醫院1呼吸與危重癥醫學科，2檢驗科，3病理科，福建 福州 350025)

目的探討反復銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)感染致大鼠氣道重構中結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表達變化及意義。方法通過多次經氣管穿刺注入一定劑量PA菌液，建立大鼠慢性肺部感染模型。觀察氣管及肺組織的病理改變, 測定氣管壁和血管壁厚度。通過免疫組化檢測肺組織CTGF蛋白的表達，同時采用real-time RT-PCR方法檢測肺組織CTGF mRNA的表達變化，分析CTGF表達與病理改變的相關性。結果大鼠感染PA第4周開始，氣管壁厚度和血管壁厚度均較NS組顯著增加(P<0.05)，至第16周，各級支氣管管壁增厚，管腔明顯狹窄，有氣道重構和肺氣腫形成。免疫組化以及real-time RT-PCR 結果顯示CTGF表達隨著時間的延長逐漸增強，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)，與氣管壁和血管壁厚度呈顯著正相關(r=0.880，r=0.829，P<0.01)。結論氣道反復感染銅綠假單胞菌可致大鼠出現氣道重構，而CTGF可能參與了氣道重構的發生和發展過程。

氣道重構； 銅綠假單胞菌； 結締組織生長因子

氣道重構(airway remodeling)是慢性阻塞性肺疾病和支氣管哮喘的重要病理特點之一，會引起氣道阻塞，肺彈性回縮力下降及肺功能的減退。研究發現，和氣道重構密切相關的病原菌有腺病毒、呼吸道合胞病毒和細菌[1-3]。然而細菌導致氣道重構的作用機制目前尚不十分清楚。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性加重期的主要責任病原菌，其感染易形成細菌生物被膜長期定殖，造成肺部反復感染[4]。然而反復銅綠假單胞菌感染能否導致氣道重構及其具體機制目前尚無深入研究。

結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一種促纖維化生長因子，屬即刻早期反應基因家族，具有自分泌和旁分泌功能而影響成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞等靶細胞，促進細胞外基質形成，對氣道重塑性疾病具有重要意義[5]。轉化生長因子β1的致纖維化作用主要是由CTGF介導的。本研究旨在通過多次經氣管穿刺注入一定劑量銅綠假單胞菌菌液的呼吸道感染方法建立大鼠慢性肺部感染模型，評價其是否具有氣道重構的病理特征，并測定肺組織CTGF的表達變化，探討其在氣道重構中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 SPF級雄性Wistar大鼠120只，體重(250±10)g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。

1.2實驗菌株 銅綠假單胞菌標準菌株(抗生素敏感試驗質控菌株)，編號ATCC27853，購于衛生部臨床檢驗中心。

1.3主要實驗藥品、試劑 RNAlater組織保護液(Qiagen)，Trizol組織裂解液(Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(Promega)，PCR試劑盒及熒光定量PCR試劑(SYBR Premix ExTaqTM)(大連TaKaRa公司)，引物(上海生工公司合成)。

2動物分組和實驗方法

2.1動物分組 大鼠基礎飼料喂養適應環境1周后，隨機分為生理鹽水對照組(NS組，60只)和銅綠假單胞菌感染組(PA組，60只)，每組預留12只大鼠備用(根據預實驗大鼠死亡率估算)，以補充因實驗操作失誤或實驗中不可避免的非人為因素導致死亡的大鼠。并將2組各剩余的48只大鼠隨機分為0 d、1 d、1周、2周、4周、8周、12周和16周組各6只。

2.2動物處理 NS組和PA組分別反復經氣管穿刺注射0.1 mL生理鹽水和0.1 mL銅綠假單胞菌菌液(0.3 mol/L，約相當于0.7×1011CFU/L)，2次/周(每周的第1 d和第4 d)，持續4周，后改為1次/周(每周的第1 d)，持續4周，停止細菌感染繼續觀察大鼠8周。8個不同時點進行相關指標的檢測。

2.3病理改變程度的判定標準及定量方法 將大鼠右肺中葉嚴格垂直于支氣管及細支氣管斷面，矢狀面最大周徑處橫貫取材，約3 mm厚，后固定，切片。組織切片置于顯微測微器(×400)下，在支氣管及細支氣管橫切面經中心點的縱軸和橫軸上測量管壁厚度，測量5個支氣管環及血管，取平均值，計算氣管壁厚度和血管壁厚度。

2.4肺組織免疫組化染色評定方法 根據免疫組化結果，觀察各組大鼠肺部氣道上皮細胞和肺泡間質細胞CTGF陽性著色為棕色顆粒沉積。每張切片隨機選擇20個視野(×200)，并計算陽性的氣道上皮細胞/總的氣道上皮細胞的百分率，求出平均值。由2位觀察者采取雙盲法對CTGF染色程度獨立評價并進行半定量評分：0分：無染色或染色非常弱；1分：陽性細胞小于25%；2分：彌漫性弱陽性著色；3分：彌漫性中等強度著色；4分：彌漫性強陽性著色。免疫染色片與HE染色片作對照觀察，以確定陽性染色出現的部位。

2.5CTGF real-time RT-PCR分析 細胞總RNA的提取按產品說明書進行，參照Reverse Transcription System 說明書合成cDNA。根據NCBI GenBank中人類GAPDH和CTGF mRNA序列，采用Primer3軟件進行引物設計，見表1。常規法PCR優化擴增條件后，于Bio-Rad iCycler PCR儀上行實時熒光定量PCR。本實驗將正常組作為基準設為對照組，先將生理鹽水組和銅綠假單胞菌組分別與對照組比較，再將生理鹽水組和銅綠假單胞菌組比較。

3統計學處理

表1 CTGF及GAPDH的引物序列

結 果

1肺部病理形態學改變

第4周:PA組大鼠氣管黏膜下可見大量腺體，杯狀細胞減少，腺體導管內可見黏液栓。細支氣管黏膜下及周圍可見淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，肺泡間隔略增寬，間質充血水腫，肺泡上皮細胞增生。NS組氣管及支氣管黏膜上皮細胞排列尚規整，杯狀細胞增生，肺內各級小支氣管、細支氣管及其伴行的管壁及周圍有少許中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，血管腔充血。肺泡間隔基本正常，間質可見紅細胞浸潤，見圖1。

第16周: PA組大鼠氣管黏膜上皮細胞排列紊亂、脫落，黏膜下平滑肌增生明顯，血管充血，支氣管杯狀細胞增殖，黏膜下層纖維化，平滑肌增厚，細胞外基質的沉積，出現氣道重構表現，呼吸細支氣管和肺泡管囊狀擴張，可見肺氣腫形成，視野中央多個肺泡相互融合，肺泡腔不規則擴大，肺泡間隔斷裂，腔略增大，有的肺泡相互融合形成肺大泡。NS組氣管及支氣管黏膜上皮細胞排列尚規整，杯狀細胞增生，肺內各級小支氣管、細支氣管及其伴行的管壁及周圍有少許中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，血管腔充血。肺泡間隔略增寬，間質可見紅細胞浸潤，見圖1。

2肺組織切片的定量分析

從第2周開始PA組大鼠氣管壁厚度明顯大于NS組，差異有統計學意義(P<0.05)，與之伴行的肺小血管管壁亦增厚，從第4周開始厚度明顯大于NS組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

Figure 1. Pathological manifestation of trachea, bronchiole and alveolus of the rats in the 2 groups at the 4th and the 16th weeks(HE staining,×200)

圖1第4周和第16周2組大鼠氣管、細支氣管和肺泡病理變化

表2 2組氣管壁厚度和血管壁厚度的比較

△P<0.05，△△P<0.01vsNS group at the same time point.

3免疫組化檢測肺組織CTGF蛋白表達水平

CTGF陽性染色主要定位于氣道纖毛上皮、血管和肺泡間質細胞。NS組大鼠僅少量氣道纖毛上皮細胞和肺泡間質細胞呈現CTGF陽性染色，且顏色淡。PA組大鼠第2周后開始出現氣道纖毛上皮細胞和肺泡間質細胞CTGF表達增強，以氣道纖毛上皮細胞明顯，強于NS組。到實驗結束時，PA組大鼠的CTGF表達明顯強于NS組,見圖2。

圖2銅綠假單胞菌感染對肺組織中CTGF蛋白表達的影響

4肺組織CTGFmRNA表達水平

隨著銅綠假單胞菌感染時間的增加CTGF表達逐漸增強，PA組大鼠感染第1 d后CTGF表達增強，明顯強于NS組，差異有統計學意義(P<0.05)。到實驗結束時，PA組大鼠的CTGF表達明顯強于NS對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 2組大鼠肺組織CTGF mRNA的表達

△P<0.05,△△P<0.01vsNS group at the same time point.

5肺部氣管和血管壁厚度與CTGF表達水平相關性分析

以銅綠假單胞菌組大鼠肺部血管壁和氣管壁厚度為應變量Y，CTGF mRNA表達水平為自變量X，進行線性相關分析，相關系數r值見表4(P<0.01)。這說明CTGF表達與氣管壁和血管壁厚度呈明顯正相關。

表4大鼠肺部氣管和血管壁厚度與CTGF表達水平的相關性

Table 4. Correlation between the expression of CTGF mRNA and the thickness of trachea wall and vessel wall of rats

CorrelatedwithCTGFmRNArPThicknessoftracheawall0.880<0.01Thicknessofvesselwall0.829<0.01

討 論

氣道重構是慢性阻塞性肺疾病和支氣管哮喘的重要病理特點之一，會引起氣道阻塞、肺彈性回縮力下降及肺功能減退。氣道重構大多是由于反復氣道慢性炎癥刺激損傷和不全性修復所導致[6]，其病理改變包括氣道管壁的增厚，上皮下層纖維化，平滑肌增生肥大，肌成纖維細胞增生，黏液腺上皮化生和細胞外基質沉積增加[7]。

反復氣道感染是COPD加重和發展最主要的原因，但它是否會引起或加重氣道重構，是否會誘發COPD，成為COPD發生的原因？Sethi等[8-9]研究認為：感染尤其是細菌感染，不僅是COPD急性加重的主要原因，很可能是 COPD 發病機制中的一個重要因素。許滸等[3]研究發現，以適量肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌，多次經鼻腔注入大鼠肺內，發現大鼠出現氣道重構和肺氣腫，具有 COPD的病理學特征。在實驗中我們參照許滸等[3]的造模方法，選擇銅綠假單胞菌作為研究對象，這是因為該細菌與COPD密切相關，是導致COPD終末期患者反復急性加重入院的主要致病菌，也是有創通氣患者容易發生定植的細菌。我們的實驗結果表明，大鼠感染PA后各級支氣管慢性炎癥明顯，管壁增厚，管腔明顯狹窄，有氣道重構和肺氣腫形成，也具有COPD的病理特征。因此，我們的結果表明反復氣道感染會導致氣道重構，也提示它既是COPD加重和發展的原因，也可能是COPD發生的原因。

在許多臟器纖維化的過程中，CTGF mRNA的表達顯著增強。CTGF的主要作用是：(1)促進細胞有絲分裂和成纖維細胞增殖，合成膠原；(2)介導細胞趨化作用；(3)誘導細胞凋亡；(4)促進血管形成[10]。因此本研究也對CTGF在氣道重構中的作用進行探討，結果顯示隨著銅綠假單胞菌感染時間的延長，CTGF在肺內的表達逐漸增加，而且主要表達位于氣道纖毛上皮細胞和肺泡間質細胞。不僅如此，我們還將CTGF與氣道壁及血管壁的厚度進行相關性分析，結果也說明兩者呈顯著正相關。這些結果均提示CTGF參與了PA感染大鼠的氣道重構過程。至于CTGF如何參與氣道重構，推測可能是CTGF作用于下游的核因子，進而促進氣管及血管平滑肌細胞增殖，趨化成纖維細胞，增加細胞外基質蛋白的合成，介導白細胞浸潤，導致氣道、血管壁增厚，引起氣道重構。但這些推測需要在今后的研究中進行驗證。

綜上所述，我們的研究表明反復氣道感染銅綠假單胞菌可致大鼠出現氣道重構，可能會誘發COPD，而CTGF可能參與了氣道重構的發生和發展過程。

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Roleofconnectivetissuegrowthfactorinairwayremodeledinratsinducedbyrepeatedbacterialinfection

WEN Wen1, LAI Guo-xiang1, LIU De-ling1, ZHANG Ya-bin2, YAO Li-qing3, WANG Ai-min1

(1DepartmentofPulmonaryandCriticalCareMedicine,2DepartmentofLaboratoryMedicine,3DepartmentofPathology,FuzhouGeneralHospital,TeachingHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Fuzhou350025,China.E-mail:laiguoxiang2007@163.com)

AIM: To investigate the role of connective tissue growth factor (CTGF) in airway remodeling in rats induced by repeatingPseudomonasaeruginosa(PA) infection.METHODSThe rats were intratracheally injected with PA for 12 times to induce chronic lung inflammation. The pathological changes of the trachea and lungs were observed, and the thickness of the trachea wall and vessel wall was measured. At the same time, the methods of immunochemistry and real-time quantitative RT-PCR were used to determine the protein and mRNA expression of CTGF in the lung tissues. The relevance between pathological changes and CTGF expression was also analyzed.RESULTSFrom the 4th week, the thickness of the trachea wall and vessel wall in infectious group was larger than that in NS group (P<0.05). At the 16th week, obvious chronic inflammation in all grade bronchi appeared, the trachea walls were thickened and the lumens were narrowed in the infected animals. The expression of CTGF was significantly up-regulated (P<0.01) with positive correlations to the thickness of the trachea wall and vessel wall (r=0.880,r=0.829,P<0.01).CONCLUSIONAirway remodeling in rats is induced by repeated injection of PA. CTGF may play some roles in the pathogenesis of airway remodeling.

Airway remodeling;Pseudomonasaeruginosa; Connective tissue growth factor

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.029