食藥用真菌粗提物促血管內皮活性的篩選及對高糖損傷內皮的保護作用*

黃華瑋， 余惠珍， 朱鵬立， 葉章正， 阮景明， 林 帆

(福建醫科大學省立臨床醫學院,福建省立醫院，福建 福州 350001)

1000-4718(2012)03-0499-07

2011-12-16

2012-02-13

福建省醫學創新基金資助項目(No. 2011-CXB-3)

△通訊作者 Tel: 0591-87557768-7058; E-mail: vivian198543@163.com

食藥用真菌粗提物促血管內皮活性的篩選及對高糖損傷內皮的保護作用*

黃華瑋， 余惠珍， 朱鵬立△， 葉章正， 阮景明， 林 帆

(福建醫科大學省立臨床醫學院,福建省立醫院，福建 福州 350001)

目的觀察古尼蟲草、花臉香菇、冬蟲夏草和巴西革耳4種食藥用真菌粗提物對高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)增殖活性的作用，篩選具有保護內皮細胞活性的有效菌菇并探討其對HUVECs細胞周期及活性氧簇(ROS)水平的影響。方法體外培養HUVECs，分為對照組 (M199正常培養液)、高糖組(33 mmol/L高糖培養液)、4種食藥用真菌(古尼蟲草、花臉香菇、冬蟲夏草和巴西革耳)粗提物干預組 (每種粗提物以終濃度12.5、25、50、100 mg/L+高糖培養液)，以四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖活性，流式細胞術檢測細胞周期及細胞內ROS水平。結果與對照組相比，高糖組HUVECs 的MTT吸光度值顯著下降,G0/G1期的細胞百分率明顯增加，S+G2/M期的細胞百分率明顯下降,且ROS水平亦增加(均P<0.05)。與高糖組相比，花臉香菇和巴西革耳粗提物干預降低了細胞吸光度值(P<0.05)，且抑制效應呈劑量依賴性增強，而古尼蟲草粗提物對其無影響。冬蟲夏草粗提物(12.5～50 mg/L)顯著提高了HUVECs的增殖活性(P<0,05)，減少了G0/G1期細胞百分率，提高了S+G2/M期的細胞百分率(P<0.05)，降低了細胞內ROS水平(均P<0.05)，且效應呈劑量依賴性增強。結論4種食藥用真菌粗提物經MTT比色法篩選后，僅冬蟲夏草粗提物對高糖誘導的HUVECs有顯著保護作用，其可能通過促進內皮細胞增殖、進入細胞周期及降低細胞內活性氧水平途徑。

食藥用真菌； 高糖； 人臍靜脈內皮細胞； 冬蟲夏草； 細胞周期； 活性氧簇

氧化應激是糖尿病血管并發癥的重要發病機制之一[1]，且血管內皮細胞是高糖毒性作用的主要靶細胞[2]。因此，減輕內皮細胞氧化應激水平，可改善內皮功能不全，進而預防、延緩和改善糖尿病血管并發癥病程進展。目前，很多人工合成抗氧化劑在有效抑制細胞活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成的同時，亦干擾了機體正常氧化還原反應，毒副作用大，因而臨床應用明顯受限[3]，故開發安全有效的天然抗氧化劑已成為現今研究熱點。

食藥用真菌具有食用價值及抗菌、抗病毒、免疫調節、抗腫瘤等多種生物活性[4]，與人類生活密切相關。近年來，發現一些食藥用真菌可通過降壓[5]、降脂[6]、降糖[7]、清除自由基[3]等作用發揮卓越的心血管保護作用，但其針對血管內皮細胞的研究甚少。因此，本實驗選取花臉香菇、巴西革耳、古尼蟲草、冬蟲夏草4種食藥用真菌粗提物，篩選出具有血管內皮細胞保護作用的菌菇，并探討其作用機制，為臨床應用天然中草藥防治糖尿病血管病變提供理論依據。

材 料 和 方 法

1材料

花臉香菇(Lepistalentinusextract，LLE)、巴西革耳 (Lentinusstriguellusextract，LSE)、冬蟲夏草(Cordycepssinensisextract，CSE)和古尼蟲草粗提物(Cordycepsgunniiextract，CGE)由福建師范大學生命科學院提供，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解(DMSO濃度<0.1%)；M199干粉培養基、胎牛血清(FBS)和0.25%胰蛋白酶/EDTA購自Gibco，膠原酶Ⅰ型購自Invitrogen，貝復濟(basic fibroblast growth factor, bFGF)購自珠海億勝生物制藥有限公司，兔抗人第八因子相關抗原免疫組化多克隆抗體及相關Ⅱ抗購自福州邁新公司，D-葡萄糖粉、DMSO、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma，活性氧檢測試劑盒購自碧云天公司。

2方法

2.1人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells ，HUVECs)的培養及鑒定 無菌操作下取行剖宮產術的健康產婦的臍帶，約30～40 cm。盡快于超凈臺中，75%乙醇擦拭臍帶表面及兩端，剪去夾痕，進行臍帶插管，用無菌PBS沖洗靜脈腔殘血，再注入預溫的1%膠原酶使之充盈，于培養箱中孵育15min后收集消化液，并用PBS沖洗靜脈腔，合并兩液，1 000 r/min離心10 min,棄上清，以M199完全培養液(含10%胎牛血清、青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L、100 mg/L貝復劑 、2 mmol/L谷氨酰胺、1×105U/L肝素)重懸細胞后，接種于25 cm2培養瓶，置于37 ℃、5%CO2培養箱。24 h后換液以去除未貼壁細胞和紅細胞，以后隔天換液，待細胞融合至80%，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化傳代，選2～5代細胞用于實驗 。采用顯微鏡下肉眼觀察結合免疫細胞化學染色法(利用兔抗人Ⅷ因子相關抗原免疫組化多克隆抗體及相關Ⅱ抗檢測Ⅷ因子)進行內皮細胞鑒定。細胞形態呈鵝卵石形態，及Ⅷ因子免疫熒光標記95%以上為陽性時可用于實驗。

2.2實驗分組及處理方法 將培養的細胞分成：(1)正常對照組：培養液為含10%血清的M199完全培養液；(2)高糖組：培養液為含33 mmol/L D-葡萄糖的10%血清M199培養液;(3)真菌粗提物+高糖組：含終濃度為12.5、25、50、100 mg/L的4種食藥用真菌粗提物+高糖M199完全培養液。按實驗分組，分別加入相應處理因素，孵育48 h后檢測相關指標。

2.3MTT比色法測定HUVECs增殖活力 收集對數生長期HUVECs，按密度5 000 cells/well接種于96孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱孵育24 h后同步化24 h，再根據上述實驗分組，每組6個復孔，并設空白對照孔(只加培養液)，同樣設6個復孔，繼續培養48 h后終止。加20 μL/well濃度0.5 g/L MTT，置于培養箱繼續培養4 h。小心吸取各孔培養液，加入150 μL/well DMSO，微振蕩15 min，選擇490 nm為測定波長，在酶聯免疫檢測儀下測吸光度(A值)，取均數反映細胞增殖活性。

2.4流式細胞儀檢測細胞周期 將細胞培養于6孔板中，同步化后按上述分組干預HUVECs 48 h后，收集各組細胞，PBS洗滌細胞2次，用70%冰乙醇5 mL固定細胞過夜，800 r/min離心5 min，PBS洗滌細胞2次，加入含RNase A的PBS 500 μL(終濃度 50 mg/L)，37 ℃水浴孵育30 min，再加入碘化丙啶PI使其終濃度為50 mg/L，4 ℃避光30 min，300目尼龍網過篩，上流式細胞儀檢測和分析。

2.5流式細胞儀檢測細胞內ROS水平 將細胞培養于6孔板中同步化后，按上述分組干預培養48 h。將處理好的細胞用PBS洗3次，每孔加入含10 μmol/L的H2DCF-DA的培養液1 mL，37 ℃避光孵育20 min；棄含熒光探針的培養液，PBS洗3次，胰酶消化，收集細胞，用流式細胞儀計數10 000個細胞，以檢測細胞內平均熒光強度反映細胞內ROS水平。

3統計學處理

結 果

1人臍靜脈內皮細胞形態及鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察發現，原代培養的臍靜脈內皮細胞最初呈圓形，單個或聚集成團。培養2～3 d，細胞生長迅速，集落增大，并開始匯合成排列較疏松的單細胞，此時細胞較大，細胞核呈橢圓形，常有2～5個核仁。4 d后，完全匯合形成連續的單層細胞，融合成片后外觀呈特征性的“鵝卵石”樣形態，排列致密，胞漿豐富,見圖1A。

免疫組化檢測Ⅷ因子相關抗原，在顯微鏡下可觀察到HUVECs陽性著色位于胞漿內和細胞核周圍，呈棕紅色，核質界限清晰，可清楚反映細胞核的形狀，見圖1B。

Figure 1. Characterization of HUVECs. A: Typical appearance of primary cultured HUVECs (×200). B: Immunohistochemistry revealed that the majority of HUVECs were factor Ⅷ relative antigen positive reaction (×200).

圖1人臍靜脈內皮細胞形態及鑒定

24種食藥用真菌粗提物對HUVECs增殖活性的影響

高糖(33 mmol/L)作用48 h后， HUVECs 的A值顯著低于正常對照組(P<0.05)。 與高糖組相比，CGE(12.5～100 mg/L)干預后HUVECs的A值無明顯改變(P>0.05)；LSE及LLE隨著干預濃度增加(12.5～100 mg/L)，各組A值均顯著降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性遞減趨勢；而CSE(12.5～50 mg/L)干預后， HUVECs的A值顯著增加(P<0.05)，并呈劑量依賴性；但在100 mg/L CSE作用下，A值反而稍下降，但較高糖組仍有所上升，且有統計學差異(P<0.05)，見圖2。

圖24種食藥用真菌粗提物對HUVECs吸光度(A值)的影響

3冬蟲夏草粗提物對HUVECs細胞周期的影響

由圖3顯示，與正常對照組比較，高糖作用48 h后，促使更多HUVECs阻滯于G0/G1期(P<0.05)，并顯著減少進入合成期(S)和分裂期(G2/M)的HUVECs(P<0.05)。而與高糖組相比，隨CSE干預濃度增加(12.5～50 mg/L)，HUVECs進入細胞S期和G2/M期的比例呈遞增趨勢(P<0.05)，且HUVECs處于G0/G1期的比例呈遞減趨勢(P<0.05)；但100 mg/L CSE對細胞周期的影響反而減少，但處于G0/G1期的細胞百分率仍低于高糖組(P<0.05),S+G2/M期的細胞百分率亦仍高于高糖組(P<0.05)。

4冬蟲夏草對高糖誘導的HUVECs內ROS水平的影響

以DCFH-DA為熒光探針，用流式細胞儀檢測HUVECs內ROS水平。結果表明，高糖干預48 h后HUVECs內的DCF熒光強度顯著高于對照組(P<0.05)。與高糖組相比，隨著CSE干預濃度的增加(12.5～50 mg/L)，細胞內的DCF熒光強度逐漸下降(P<0.05)，但100 mg/L CSE的熒光強度反而略升高,但仍低于高糖組(P<0.05)，見圖4。

圖3冬蟲夏草粗提物對HUVECs細胞周期分布的影響

圖4冬蟲夏草粗提物對HUVECs活性氧的影響

討 論

微血管及大血管病變是糖尿病患者致殘和死亡的首要原因[8-9]。目前認為，氧化應激、糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、炎癥反應、糖基化反應等多種因素貫穿發病始末，緊密關聯，并形成正反饋循環[8-9]。而血管內皮功能障礙廣泛存在于糖尿病患者中，是糖尿病血管病變的早期重要事件[10]，由此阻斷糖尿病血管病變相應致病環節，打破多個致病因素交互而形成的惡性循環，從而改善血管內皮功能，對防治糖尿病血管病變發生發展，提高患者生存率及生活質量尤為重要。

因此，本實驗選用高糖刺激的HUVECs損傷，模擬糖尿病時血管內皮發生的病理改變。MTT比色法是測定活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶含量，其與細胞數量、細胞活性成正比，已廣泛應用于檢測多種生物活性因子的活性，藥物毒性等，也因其具有簡單、快捷、經濟、準確等優點，成為藥物活性體外篩選的常用方法。本實驗應用MTT法發現，高糖刺激明顯降低了血管內皮細胞的增殖活性，花臉香菇和巴西革耳粗提物可進一步抑制高糖誘導的HUVECs的活性，且抑制作用呈濃度依賴性；而古尼蟲草粗提物對內皮細胞的增殖活性無明顯影響。該結果提示，花臉香菇、古尼蟲草、巴西革耳從藥效學角度可能被視為無效。但食藥用真菌成分復雜，含有豐富多樣的生物活性物質，如：多糖、肽類、萜類、腺苷等，且不同單體可各自發揮著不同甚至相互拮抗的生物學效應。因此，雖然中草藥的粗提物形式能很大程度地反映藥物的組成和功用，但由于不同食藥用真菌具有生物活性或醫療效用的單體成分的組成比例存在差異，故粗提物無保護血管內皮的藥理學效應，并不意味著它們就不具有可發揮保護內皮作用的單體成分。所以，本實驗尚不能排除花臉香菇、巴西革耳以及古尼蟲草在保護血管內皮領域的潛在可能性，是否再通過其它的檢測手段，有待于進一步研究證實。

冬蟲夏草是我國一種名貴的中草藥，其富含核苷類、蟲草酸、多糖及多種氨基酸、維生素和微量元素等生物活性成分，在抗腫瘤、保護調節腎臟、肝臟及心肺功能等領域有較為明確的作用[8]。以國產寧心寶膠囊為代表的蟲草制劑已廣泛使用于臨床，在抗心律失常、降血脂、血壓方及心肌保護方面取得良好療效[11]。近年來的動物實驗發現冬蟲夏草可改善腎性高血壓大鼠的血管重構[12]及行頸動脈球囊剝脫術SD大鼠的大動脈平滑肌遷移和增生[13]等血管病理改變，但至今國內外關于冬蟲夏草對血管內皮細胞發揮直接保護作用卻鮮有報道。與此同時，冬蟲夏草應用于糖尿病及并發癥的研究亦成為新的熱點[14]，故冬蟲夏草能否防治糖尿病血管病變值得探討。本研究發現，冬蟲夏草粗提物可改善高糖對HUVECs增殖活性的抑制作用。業已證實，細胞能否順利通過G1-S限制點和G2-M限制點是細胞能否進入增殖狀態的關鍵，其中前者作為細胞內、外信號傳遞并整合匯入細胞核對細胞增殖進行調控的關鍵點更為重要。若G1-S限制點被抑制，進入細胞周期的細胞數減少，細胞更多地停滯于G0/G1期，S期和G2/M期細胞比例降低，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。本研究發現高糖誘導后HUVECs阻滯于G0/G1期的百分比明顯增高，S期和G2/M期細胞百分比下降，而冬蟲夏草干預后逆轉了高糖誘導的細胞周期分布情況，提示冬蟲夏草通過促進更多細胞進入細胞周期，從而改善高糖損傷后內皮細胞活力。推測此現象可能與冬蟲夏草富含氮、磷等元素有關，這為DNA合成分裂提供大量的可利用性營養；亦可能通過影響細胞周期相關調控蛋白如P53、P21等的表達而影響細胞周期，促進內皮細胞的增殖活性。正常血管內皮細胞凋亡率和增殖率都很低，且兩者平衡以保持血管內皮穩態，而高糖損傷的內皮細胞在凋亡加速的同時，伴隨增殖活力下降，無法對損傷的內皮細胞進行及時修復，內皮微環境的平衡被打破[15]。而冬蟲夏草可能通過增加內皮細胞增殖活力，減少細胞凋亡，重建內皮穩態。本研究中，發現低、中劑量的冬蟲夏草粗提物(12.5～50 mg/L)可拮抗高糖對HUVECs增殖的抑制作用，減少細胞凋亡的發生，且具有量效依賴性。而高劑量(100 mg/L)冬蟲夏草粗提物對細胞的保護作用反而下降，可推測在更高劑量下，其可能具有細胞毒作用，故此現象也客觀地反映了藥物的“雙刃劍”作用。

高血糖使機體系統和局部血管內皮細胞內ROS生成增多，包括超氧陰離子、羥自由基和H2O2等，同時抗氧化蛋白(如Cu/Zn-SOD)因糖基化作用而失活導致抗氧化防御屏障減弱，機體氧化-抗氧化失衡，ROS蓄積形成氧化應激狀態[16-17]，并與糖代謝紊亂形成惡性循環，貫穿糖尿病的始終。ROS可通過脂質過氧化、激活轉錄因子(如NF-κB)、干擾NO的生物利用度等直接損傷內皮；也可通過氧化LDL，形成AGEs、激活血小板和單核細胞等間接損傷內皮細胞[8]。目前，已有大量藥理學研究以內皮細胞氧化應激水平為靶點，抑制血管內皮損傷進而干擾糖尿病血管并發癥的發生發展。因此抗氧化治療將打破氧化應激與糖代謝紊亂的惡性循環，成為糖尿病治療的新策略。本研究尚顯示，冬蟲夏草不同程度地降低了內皮細胞內的ROS水平，故認為冬蟲夏草卓越的抗氧化作用可能是其發揮內皮保護作用的重要機制之一，推測可能與直接清除自由及增強細胞內抗氧化系統的抗氧化能力兩種途徑有關。

總之，本研究經過MTT法篩選發現，冬蟲夏草可以通過促進細胞增殖活性、改變細胞周期分布及細胞內氧化應激水平來改善HUVECs損傷，從而可能發揮保護血管內皮細胞效應。而花臉香菇、巴西革耳、古尼蟲草對高糖損傷的人臍內皮細胞增殖活性并無改善作用。

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Effectsofedible-medicinalfunguscrudeextractsonvascularendothelialcellswithhighglucose-inducedinjury

HUANG Hua-wei, YU Hui-zhen, ZHU Peng-li, YE Zhang-zheng, RUAN Jing-ming, LIN Fan

(ProvincialClinicalCollegeofFujianMedicalUniversity,FujianProvincialHospital,Fuzhou350001,China.E-mail:vivian198543@163.com)

AIM: To investigate the effects of crude extracts ofCordycepsgunnii(CGE),Lepistalentinus(LLE),Cordycepssinensis(CSE) andLentinusstriguellus(LSE) on the proliferation of high glucose-treated human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSThe cultured HUVECs were divided into normal control group (treated with M199 culture medium alone), high glucose group (treated with M199 culture medium containing 33 mmol/L glucose) and 4 crude extracts of edible-medicinal fungi (CGE, LLE, CSE and LSE) intervention groups (treated with the crude extract of edible-medicinal fungus at concentrations of 12.5, 25, 50, 100 mg/L in high glucose M199 culture medium). The cell proliferation was evaluated by MTT assay. The cell cycle and ROS level were measured by flow cytometry.RESULTSCompared with normal control group, the MTT absorbance value and the percentage of G0/G1stage of the HUVECs in high glucose group were significantly decreased (P<0.05), while the percentage of S+G2/M and ROS level were significantly increased (P<0.05). Compared with high glucose group, treatment with the crude extracts ofLepistalentinusandLentinusstriguellusdecreased the cell absorbance value (P<0.05), and the inhibitory effect was enhanced in a dose-dependent manner. However,Cordycepsgunniihad no effect (P>0.05). The crude extracts ofCordycepssinensis(12.5～50 mg/L) significantly enhanced the proliferative activity of HUVECs, decreased the percentage of G0/G1stage of HUVECs, increased the percentage of S+G2/M of HUVECs, and reduced the intercellular ROS level (P<0.05).CONCLUSIONOnlyCordycepssinensiscrude extract effectively protects the HUVECs in high glucose-induced injury, which might be due to promoting more cells to enter to the cell cycle and down-regulating oxidative stress.

Edible-medicinal fungi; High glucose; Human umbilical vein endothelial cells;Cordycepssinensis; Cell cycle; Reactive oxygen species

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.020