NAC-1特異的siRNA增強紫杉醇誘導的人卵巢癌細胞凋亡*

桂 玲， 王 靜， 祝愛珍， 劉成成， 劉革修△

(1湖南省腫瘤醫院婦瘤科，湖南 長沙 410013；2暨南大學醫學院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)03-0439-06

2011-09-29

2011-11-07

湖南省衛生廳科研計劃資助項目(No.B2011-089)

△通訊作者 Tel：020-85220262；E-mail: tliugx@jnu.edu.cn

NAC-1特異的siRNA增強紫杉醇誘導的人卵巢癌細胞凋亡*

桂 玲1， 王 靜1， 祝愛珍2， 劉成成2， 劉革修2△

(1湖南省腫瘤醫院婦瘤科，湖南 長沙 410013；2暨南大學醫學院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

目的探討NAC-1 (nucleus accumbens-1)基因特異的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)聯合紫杉醇誘導人卵巢癌HO8910細胞凋亡的協同作用及其可能機制。方法測定不同濃度NAC-1基因特異的siRNA與紫杉醇單用或者合用對HO8910細胞增殖與凋亡的作用，設立陰性siRNA對照和空白對照。以實時熒光定量RT-PCR 檢測NAC-1 mRNA表達水平、Western印跡法檢測NAC-1蛋白、表皮生長因子受體(EGFR)下游信號磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化細胞外信號調節激酶(p-ERK),以MTT法檢測細胞增殖率，流式細胞術檢測細胞周期分布和凋亡。結果單用NAC-1基因特異的siRNA作用48 h能抑制HO8910細胞NAC-1 mRNA和蛋白的表達，分別下調71.2%和80.5%，細胞周期被阻滯于G1期，p-Akt和p-ERK蛋白水平分別下降43.7%和49.8%；作用72 h細胞增殖被抑制45.6%，與轉染陰性siRNA 及未轉染組比較，差異顯著(P<0.05)。NAC-1 siRNA(0.5 μmol/L)與紫杉醇(2 μmol/L)聯合作用于卵巢癌HO8910細胞72 h細胞凋亡率為(30.93±4.57)%，顯著高于單用紫杉醇時的細胞凋亡率[(23.85±3.65)%]，P<0.05。結論靶向抑制NAC-1基因表達能顯著抑制卵巢癌HO8910細胞增殖，增強其對紫杉醇的敏感性，這與部分抑制EGFR下游信號途徑有關。

Nucleus accumbens-1蛋白； 紫杉醇； 卵巢腫瘤； 細胞增殖； 細胞凋亡

紫杉醇(paelitaxel)是目前治療卵巢癌的重要藥物，有效改善了卵巢癌患者的生存率。但是臨床應用發現其存在一些缺陷，一方面癌細胞對其易產生耐藥性，另一方面，患者出現骨髓抑制、過敏反應、胃腸道反應、神經毒性反應、心臟毒性反應、關節/肌肉痛、肝臟毒性反應、腎臟毒性反應等不良反應。所以，研究增強其抗癌效果和/或者減少其不良反應的方法具有重要意義。

最近研究發現，卵巢癌發生、發展及其治療效果與卵巢癌干細胞具有密切關系[1-7]。Nakayama等[8]和Jinawath等[9]研究不僅發現NAC-1 (nucleus accumbens-1)是一種極強的干細胞因子，而且證實在漿液性卵巢癌組織和細胞株中NAC-1表達和紫杉醇體外耐藥相關，通過部分抑制Gadd45gip1的表達、負向調節Gadd45腫瘤抑制途徑的組成包括Gadd45α和其結合蛋白Gadd45gip1，從而促進腫瘤的生長和存活。所以，為了增強紫杉醇作用、減少其不良反應，本研究采用RNA干擾技術沉默NAC-1基因以協同紫杉醇抑制卵巢癌HO8910細胞增殖并誘導凋亡，探索卵巢癌治療的新的聯合方法，為臨床提供依據。

材 料 和 方 法

1材料和試劑

人卵巢癌細胞系HO8910購自中國科學院上海細胞生物研究所，由暨南大學生命科學技術學院生殖研究室保存；RPMI-1640培養液購于Gibco；新生牛血清購于杭州四季青生物工程科技有限公司；MTT購于Sigma；脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM2000購于Invitrogen；Trizol、反轉錄試劑盒和SYBR GreenⅠMix試劑盒購自Tiangen;MTT試劑盒、蛋白裂解液和電化學發光(electrochemilum-inescence，ECL)試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；以NAC-1基因為靶標的特異性siRNA和陰性對照siRNA均由廣州市銳博生物科技有限公司合成及純化。磷酸化Akt[phosphorylated Akt，p-Akt(Ser473)]多克隆抗體購自Santa Cruz；NAC-1多克隆抗體和磷酸化細胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)多克隆抗體購自Cell Signaling Technology。

2靶向NAC-1基因寡核苷酸的設計

根據NAC-1基因的序列號NM-052876.21，遵循siRNA設計規則設計siRNA序列，使用BLAST程序對序列進行人類基因組相似性評估證實序列在人類基因組中具有唯一性。經預實驗篩選出NAC-1基因特異性高效的siRNA：5’-UGACAGGCACCAACGUGUACA-3’；陰性對照siRNA：5’-GACTTCATAAGGCGCATGC-3’，與已知的人類基因無同源性。

3細胞培養與實驗分組

將對數生長期的人卵巢癌HO8910細胞以1×105細胞/瓶接種于75 cm2培養瓶，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養于5%CO2、37 ℃培養箱中。當細胞生長至約70%匯合度時，以每孔100 μL(5×103細胞)接種于96孔板，細胞貼壁后，分別加入不同濃度的紫杉醇(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0 μmol/L)、不同濃度的NAC-1-siRNA(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60和3.20 μmol/L)以及NAC-1 siRNA 0.5 μmol/L，此濃度根據單用NAC-1 siRNA的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)確定]聯合不同濃度的紫杉醇(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0 μmol/L)，進行藥物干預，每個濃度設3個復孔。同時設空白對照組、僅含有DMSO的陰性對照組和陰性siRNA (negative siRNA)組。siRNA轉染參考試劑盒說明書。

4MTT法檢測細胞增殖活性

繼續培養72 h后，每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，37 ℃培養4 h后低速離心10 min吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min使沉淀充分溶解，用酶聯免疫檢測儀在波長490 nm處測定吸光度(A)值。細胞生長抑制率=(實驗組平均A值-空白組平均A值)/(對照組平均A值-空白組平均A值)×100%。采用直線回歸方法計算藥物的IC50值。實驗重復3次。

5細胞周期與凋亡檢測

采用PI單染流式細胞術檢測細胞周期：siRNA處理48 h后，收集、洗滌細胞，冰預冷的70%乙醇，4 ℃固定24 h；離心去乙醇, PBS漂洗,加入50 mg/L PI、20 mg/L RNase、1 g/L枸櫞酸鈉、1% Triton X-100,上機檢測。采用AnnexinⅤ/PI雙熒光染色法分析細胞凋亡：收集siRNA、紫杉醇單用或者聯用72 h后的細胞，用冷PBS洗滌2次，加入結合緩沖液重懸細胞，調整細胞密度為1×109/L。吸取100 μL細胞懸液，加入AnnexinⅤ-FITC溶液5 μL，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，再加碘化丙啶(propidium iodide，PI)10 μL，混勻后避光并室溫下孵育5 min，加入結合緩沖液400 μL，立即上流式細胞儀分析。以未染色細胞調零，以AnnexinⅤ-FITC單染管和PI單染管作為基準對照，測定每個上樣管數據，測定凋亡細胞百分比。

6計算紫杉醇和NAC-1siRNA的聯合作用效果

根據中效原理，采用Chou-Talalay聯用指數法[10]來判定2種藥物對HO8910細胞增殖的聯合作用。按中效方程式計算出不同抑制率時兩藥的單用和聯用濃度，公式如下：D=Dm[fa/(1-fa)]1/m；式中D為藥物濃度，Dm為中效濃度，fa為細胞增殖抑制率，m為斜率。2種藥物的聯用指數(combination index，CI)的計算公式如下：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+a(D)1(D)2/ (Dx)1(Dx)2；其中(Dx)1和(Dx)2分別為2種藥物單用時產生某一效應值fa時的濃度，(D)1和(D)2則是2種藥物聯用時產生相同效應fa時各自所需要的濃度。當2種藥物的相互作用為非排斥性時，a=1；當2種藥物的相互作用為排斥性時，a=0。求出CI值，如果CI<1，認為兩藥物聯用為協同作用；如果CI=1，認為兩藥聯用為相加作用；如果CI>1，則認為兩藥聯用為拮抗作用。

7實時熒光定量RT-PCR法檢測NAC-1mRNA表達

處理48 h后收集細胞，提取總RNA并用紫外分光光度計定量，取1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板、NAC-1基因特異性引物進行實時熒光定量PCR分析，根據2-ΔΔCt方法分析目的基因的mRNA相對表達水平。NAC-1基 因 上 游 序 列 為 5 ’ - CCAGACACTGCAGATGGAGA-3’，下游序列為5’-AAGCTGAGGATCTGCTGGAA-3’，擴增片段為227 bp；內參照GAPDH 上游序列為5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’，下游序列為5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’，擴增片段為219 bp。

8Western印跡法檢測蛋白水平

處理48 h后收集細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白30 μg上樣，進行10%SDS-PAGE，120 V恒壓電泳1 h，200 mA恒流轉膜1 h。然后，用含5%脫脂奶粉的TBST對膜封閉30 min，加入抗人NAC-1、p-Akt(Ser473)抗體、p-ERK抗體或兔抗人GAPDH抗體(Sigma)于4 ℃孵育過夜，第2 d加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的相應Ⅱ抗IgG(稀釋比例為1∶3 000)于室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。最后，ECL發光顯色，采集圖像，采用Gel-Pro 4.0軟件對目的蛋白進行定量分析。以GAPDH作為內參照。

9統計學處理

結 果

1NAC-1siRNA、紫杉醇單用或者合用對卵巢癌HO8910細胞增殖的影響

MTT檢測結果顯示，NAC-1 siRNA和紫杉醇分別以不同濃度單獨作用于HO8910細胞72 h，均顯示抑制細胞增殖作用，且在一定濃度范圍內呈濃度依賴性，見表1，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。NAC-1 siRNA作用72 h的IC50值為(0.82±0.08)μmol/L，而紫杉醇的IC50值為(3.81±0.56)μmol/L。根據合用指數計算公式，計算出NAC-1 siRNA和紫杉醇合用在不同效應(0.90、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.50、0.40)時的CI分別為0.534、0.574、0.593、0.674、0.737、0.835、0.936、0.941。結果顯示當fa為0.90、0.80、0.75、0.65、0.60、0.50、0.40時兩藥作用為協同。

表1不同濃度NAC-1siRNA與紫杉醇單用或合用對HO8910細胞的生長抑制率

Drug(μmol·L-1)InhibitoryrateNAC-1siRNA 0.0515.38±1.37 0.1020.42±1.96 0.2027.88±2.81 0.4038.54±3.57 0.8049.43±3.96 1.6065.17±4.35 3.2073.11±4.58Paelitaxel 0.57.34±1.65 1.013.72±1.85 2.031.99±2.32 4.055.87±3.80 8.067.74±4.92 16.078.91±5.15 32.082.20±5.06NAC-1siRNA+paelitaxel 0.5+0.545.63±3.68* 0.5+1.053.47±4.31* 0.5+2.067.90±4.93* 0.5+4.079.50±5.23* 0.5+8.083.75±5.49* 0.5+16.090.00±5.53* 0.5+32.092.52±5.86

*P<0.05vsthe concentration-matched paelitaxel groups.

2NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細胞NAC-1基因表達水平的影響

實時熒光定量PCR和Western印跡法結果顯示，轉染NAC-1特異siRNA(0.5 μmol/L)能有效沉默NAC-1基因的表達, NAC-1 mRNA和蛋白表達水平分別下降71.2%和80.5%，與空白對照組、陰性siRNA組相比較，差異有統計學意義(P<0.05) ，見圖1A、B。

圖1NAC-1基因特異性siRNA轉染對卵巢癌HO8910細胞細胞中NAC-1基因表達的影響

3NAC-1siRNA單用對卵巢癌HO8910細胞表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)下游信號分子活性的影響

Western blotting結果顯示，0.5 μmol/L濃度的NAC-1 siRNA能抑制EGFR活性，其下游信號蛋白Akt和ERK活性被抑制，作用48 h后，不僅NAC-1蛋白水平顯著下降，而且細胞p-Akt和p-ERK活性水平也顯著下降，分別下降(43.70±4.25)%和(49.80±4.38)%，見圖2。

Figure 2. Effects ofNAC-1 siRNA on NAC-1 protein and the activity of protein kinases of EGFR downstream signaling pathway in ovarian cancer HO8910 cells. Con：control; Neg：negative siRNA; Exp：NAC-1 siRNA.

圖2NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細胞NAC-1蛋白和EGFR信號途徑下游蛋白激酶活性的影響

4NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細胞周期分布的影響

細胞周期檢測結果顯示，空白對照組與陰性siRNA組中卵巢癌HO8910細胞的細胞周期分布差異無統計學意義(P>0.05)，而轉染NAC-1 siRNA后G1期HO8910細胞比例顯著增高(P<0.05)，見圖3、表2，提示NAC-1 siRNA轉染能夠阻滯細胞周期在G1期。

5NAC-1siRNA單用或者與紫杉醇合用對卵巢癌HO8910細胞凋亡的影響

FCM法檢測結果顯示，用濃度低于IC50的NAC-1 siRNA(0.5 μmol/L)或紫杉醇(2.0 μmol/L)單獨作用于卵巢癌HO8910細胞72 h后，細胞凋亡率分別為(7.63±2.38)%和(23.85±3.65)%；而將NAC-1 siRNA(0.5 μmol/L)和紫杉醇(2.0 μmol/L)聯合作用72 h后，HO8910細胞的凋亡率為(30.93±4.57)%。聯合用藥組的細胞凋亡率高于單獨用藥組，差異有統計學意義(P<0.05)；且隨著兩者的濃度增加，細胞凋亡率亦呈增高趨勢。由此可見，NAC-1 siRNA可增強紫杉醇誘導細胞凋亡的作用。

Figure 3. Effect ofNAC-1 siRNA on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells analyzed by flow cytometry.

圖3FCM法檢測NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細胞周期分布的影響

表2NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細胞細胞周期分布的影響

GroupG0/G1SG2/MControl42.38±5.7324.92±4.4731.70±4.74NegativesiR-NA45.68±5.9522.45±4.6031.87±4.66NAC-1siRNA62.53±6.73*12.99±3.1024.48±3.84

*P<0.05vscontrol.

討 論

NAC-1屬于BTB/POZ轉錄因子家族成員，是干細胞多能性因子。NAC-1通過調節其它多能分化因子的表達，如Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall1 和 Sall4等，參與蛋白質間的相互作用和轉錄調控網絡，參與胚胎干細胞的自我更新和多能性分化，對胚胎干細胞的多能分化是至關重要的[8]。最近研究顯示，NAC-1在多種惡性腫瘤中表達上調，包括：胰癌、大腸癌、乳腺癌、腎細胞癌、肝癌和宮頸癌[11]。Ishibashi等[12]在卵巢癌研究中發現化療后復發的患者體內NAC-1表達水平明顯高于初發未治者。Nakayama等[8]和Jinawath等[9]則不僅證實在漿液性卵巢癌組織和細胞株中NAC-1表達和紫杉醇體外耐藥相關，而且發現，NAC-1通過部分抑制Gadd45gip1的表達、負向調節Gadd45腫瘤抑制途徑的組成包括Gadd45α和其結合蛋白Gadd45gip1，從而促進腫瘤的生長和存活。Ueda等[13]則發現NAC-1對于維持卵巢癌細胞中脂肪酸合成酶蛋白和mRNA水平的表達必不可少，并與卵巢癌復發有關。這些資料表明，NAC-1是高度惡性的卵巢癌復發相關基因。

本研究結果顯示，通過脂質體轉染方法將NAC-1 siRNA導入卵巢癌細胞后，不僅能有效沉默NAC-1基因，抑制NAC-1 mRNA與蛋白表達，而且細胞的生長活性明顯受到抑制、細胞周期被阻滯于G1期，同時部分抑制EGFR下游信號途徑，p-Akt和p-ERK水平顯著下降；NAC-1 siRNA和紫杉醇合用則進一步增強了紫杉醇誘導HO8910細胞凋亡作用。結果表明NAC-1在卵巢癌細胞的生長和存活中起著重要的作用，NAC-1 siRNA能提高卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性。這為改善卵巢癌臨床治療方法提供新的依據。

[1] Hu L, McArthur C, Jaffe RB. Ovarian cancer stem-like side-population cells are tumourigenic and chemoresistant[J]. Br J Cancer, 2010, 102(8):1276-1283.

[2] Dyall S, Gayther SA, Dafou D. Cancer stem cells and epithelial ovarian cancer[J].J Oncol, 2010, 2010:105269.

[3] Alvero AB, Chen R, Fu HH, et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance[J].Cell Cycle, 2009, 8(1):158-166.

[4] Szotek PP, Pieretti-Vanmarcke R, Masiakos PT, et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(30):11154-11159.

[5] Bapat SA, Mali AM, Koppikar CB, et al. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2005, 65(8):3025-3029.

[6] Zhang S, Balch C, Chan MW, et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors[J]. Cancer Res, 2008, 68(11):4311-4320.

[7] Kobayashi Y, Seino K, Hosonuma S, et al. Side population is increased in paclitaxel-resistant ovarian cancer cell lines regardless of resistance to cisplatin[J]. Gynecol Oncol, 2011, 121(2):390-394.

[8] Nakayama K, Nakayama N, Wang TL, et al.NAC-1 controls cell growth and survival by repressing transcription of Gadd45GIP1, a candidate tumor suppressor[J]. Cancer Res, 2007, 67(17):8058-8064.

[9] Jinawath N, Vasoontara C, Yap KL, et al.NAC-1, a potential stem cell pluripotency factor, contributes to paclitaxel resistance in ovarian cancer through inactivating Gadd45 pathway[J]. Oncogene, 2009, 28(18):1941-1948.

[10]Chou TC. Preclinicalversusclinical drug combination studies[J]. Leuk Lymphoma, 2008, 49(11):2059-2080.

[11]Nakayama K, Nakayama N, Davidson B, et al. ABTB/POZprotein, NAC-1, is related to tumor recurrence and is essential for tumor growth and survival[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(49):18739-18744.

[12]Ishibashi M, Nakayama K, Yeasmin S, et al. A BTB/POZ gene,NAC-1, a tumor recurrence-associated gene, as a potential target for Taxol resistance in ovarian cancer[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(10):3149-3155.

[13]Ueda SM, Yap KL, Davidson B, et al. Expression of fatty acid synthase depends on NAC1 and is associated with recurrent ovarian serous carcinomas[J]. J Oncol, 2010, 2010:285191.

NAC-1-specificsiRNAenhancespaelitaxel-inducedapoptosisofovariancancercelllineHO8910

GUI Ling1, WANG Jing1, ZHU Ai-zhen2, LIU Cheng-cheng2, LIU Ge-xiu2

(1DepartmentofGynecologicOncology,HunanProvincialTumorHospital,Changsha410013,China;2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effect ofNAC-1-specific siRNA alone, or in combination with paelitaxel on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cell line HO8910.METHODSOvarian cancer cells were treated withNAC-1 siRNA alone or in combination with paelitaxel. The level of NAC-1 mRNA was assessed by real-time quantitative PCR. Western blotting analysis was used to detect NAC-1 protein and the activation of epidermal growth factor receptor(EGFR) downstream signals,Akt and ERK. The cell proliferation rate was measured by MTT assay, and the cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry.RESULTSAfter treated withNAC-1-specific siRNA for 48 h, the expression of NAC-1 at mRNA and protein levels in HO8910 cells decreased by 71.1% and 80.5%, respectively. The cells in G1phase increased. The protein levels of p-Akt and p-ERK were decreased by 43.7% and 49.8%, respectively. After treated withNAC-1-specific siRNA for 72 h, the proliferation inhibitory rate of the cells was increased to 45.6% as compared with the cells treated with negative siRNA. Apoptotic rate of the cells treated withNAC-1 siRNA (0.5 μmol/L combined with 2 μmol/L of paelitaxel) for 72 h was (30.93±4.57)%,higher than that of the cells treated with paelitaxel alone[(23.85±3.65)%].CONCLUSIONNAC-1 siRNA suppressesNAC-1 gene expression and EGFR downstream signaling activation, inhibits cell proliferation and enhances the responsiveness of ovarian cancer cells to paelitaxel. The combination treatment produces synergistic inhibition.

Nucleus accumbens-1 protein; Paelitaxel; Ovarian neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis

R737.14

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.010