下調X連鎖調亡抑制蛋白基因表達增強多西他賽誘導膀胱癌細胞凋亡的作用*

盧 瑜， 方 勇

(1南京軍區杭州療養院，浙江 杭州 310007；2浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院腫瘤內科，浙江 杭州 310016)

1000-4718(2012)03-0427-06

2011-10-15

2011-12-14

浙江省中醫藥青年基金資助項目(No.2005-A-12)

△通訊作者 Tel:0571-86006926 ;E-mail：fyzju@sina.com

下調X連鎖調亡抑制蛋白基因表達增強多西他賽誘導膀胱癌細胞凋亡的作用*

盧 瑜1， 方 勇2△

(1南京軍區杭州療養院，浙江 杭州 310007；2浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院腫瘤內科，浙江 杭州 310016)

目的觀察人源性膀胱癌細胞在下調X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)基因表達后，多西他賽對其敏感性的影響。方法以shRNA和shRNA-XIAP質粒分別穩定轉染人源性膀胱癌T24T細胞。以熒光顯微鏡觀察轉染細胞。以RT-PCR和Western blotting法分別檢測膀胱癌細胞XIAP mRNA和蛋白的表達。與T24T以及轉染空載體的T24T細胞相比較，以ATPase法檢測多西他賽對轉染XIAP基因的膀胱癌細胞的細胞毒性。相差顯微鏡下觀察,流式細胞術檢測多西他賽預處理轉染XIAP基因的膀胱癌細胞的凋亡率；以Western blotting法檢測細胞內的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)和caspase-3蛋白表達和裂解水平。結果熒光顯微鏡下分別觀察shRNA和shRNA-XIAP轉染的T24T細胞，均見穩定熒光。Western blotting和RT-PCR檢測結果顯示，人源性膀胱癌T24T細胞在穩定轉染反義XIAP基因后，其XIAP蛋白和mRNA水平均顯著降低。經多西他賽處理24 h后, 轉染反義XIAP基因的T24T細胞IC50為(1.23±0.62)nmol/L，遠低于T24T以及轉染空白載體的對照組細胞[(8.22±1.23) nmol/L，(8.35±0.98) nmol/L，P<0.01]。流式細胞術檢測結果顯示， T24T shRNA-XIAP細胞組(2 nmol/L和5 nmol/L)凋亡率[(41.45±6.23)%和(74.82±5.46)%]顯著高于轉染空載體細胞的凋亡率[(25.34±3.81)%和(34.14±6.25)%，P<0.01]。與轉染空載體的細胞相比較，T24T shRNA-XIAP細胞內的PARP和caspase-3明顯降低。結論下調膀胱癌細胞的XIAP基因表達后，可顯著增強化療藥物多西他賽所誘導的膀胱癌細胞的凋亡，并增強多西化賽的細胞毒性。

T24T細胞； X連鎖凋亡抑制蛋白； 多西他賽； 細胞凋亡

世界范圍內，膀胱癌發病率居惡性腫瘤的第9位，男性排名第6位，女性排在第10位之后[1]。中國男性膀胱癌發病率位居全身腫瘤的第8位，女性排在第12位以后。但近年來我國部分城市腫瘤發病率報告顯示膀胱癌發病率有增高趨勢。

大部分膀胱癌患者確診時處于分化良好或中等分化的非肌層浸潤性膀胱癌，但其中約25%的患者最終可發展為肌層浸潤性膀胱癌或轉移性膀胱癌[2]。患者出現遠處轉移病灶后，需要接受化放療治療。患者常接受包括多西他賽(docetaxel)在內的二線藥物治療方案[3]。但由于腫瘤細胞易對化療藥物產生耐受性, 藥物治療常達不到滿意的療效。

X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是哺乳動物細胞內存在的一種抑制凋亡蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs),能直接和caspases家族成員中介導蛋白酶級聯下游效應分子caspase-3、caspase-7和caspase-9結合并抑制其活性, 并可抑制化療藥物、紫外線照射、Bax誘導的凋亡[4]。有研究顯示, 腫瘤細胞中XIAP水平的升高是腫瘤細胞逃避化療藥物殺傷作用的原因之一[5]。近些年， XIAP在腫瘤化療敏感性中的作用及價值受到了國內外學者越來越多的重視。并在多種腫瘤中，如在胃癌、肺癌、胰腺癌和肝癌細胞系中均證明下調XIAP蛋白水平，可提高腫瘤對化療藥物的敏感性。在本研究中，我們以shRNA技術沉默XIAP基因，觀察多西他賽藥物誘導膀胱癌細胞的細胞毒性和凋亡效應的影響, 以探索改進膀胱癌化療療效的新方法。

材 料 和 方 法

1材料

真核表達載體shRNA-XIAP和空白載體購自Open Biosystem(載體包含GFP熒光顯色)。轉染試劑LipofectamineTM購自Invitrogen。XIAP、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]、caspase-3和GAPDH抗體均購自Santa Cruz。新生牛血清、DMEM、TRIzol? Reagent Kit和嘌吟霉素(puromycin)購自Gibco。 二甲基亞砜(DMSO)和ATP生物熒光檢測試劑盒購自Promega。多西他賽為法國賽諾菲-安萬特制藥廠產品。高表達XIAP基因的人源性膀胱癌細胞T24T購自ATCC,細胞在含有10%新生牛血清、100 kU/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的 DMEM/F12培養基、37 ℃、5% CO2條件下培養, 每3 d/傳代1次。

2方法

2.1分組 轉染細胞設置未轉染對照組、shRNA表達質粒轉染組和shRNA-XIAP融合質粒轉染組。基因轉染步驟參照LipofectamineTM試劑盒說明書進行，分別在轉染后24、48 和72 h于熒光倒置顯微鏡下觀察GFP熒光。轉染72 h后, 加入嘌呤霉素篩選4周，終濃度5 mg/L。克隆細胞形成后, 隨機挑選克隆,擴增抗性細胞, 熒光顯微鏡觀察細胞內GFP表達熒光。

2.2T24T細胞XIAP mRNA和蛋白表達的檢測 收集細胞約1×106, 按TRIzol?試劑盒說明書提取總RNA，采用Invitrogen公司RT-PCR試劑盒。逆轉錄反應體系: 模板RNA 2 μg, 10 mmol/L dNTP 1 μL, RNA酶抑制劑(RNasin)1 μL,Oligo dT 1.5 μL, AMV逆轉錄酶1 μL, 5×逆轉錄酶緩沖液5 μL, 終體積為25 μL, 50 ℃ 50 min， 采用Pub Mediline的Primer Blast軟件設計XIAP基因PCR引物(擴增產物大小281 bp),上游引物5’-TTTCCAGATTGGGGCTCGGG-3’,下游引物5’-CCCTGCTCGTGCCAGTGTTGAT-3’,由上海捷倍思基因技術有限公司合成。同時以GADPH作為內參照。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳， MGIAS-1000凝膠成像系統掃描定量并拍照。采用Western blotting法檢測轉染細胞株XIAP蛋白表達情況。即胰酶消化收集細胞，PBS洗2次，加入蛋白提取液提取細胞總蛋白。Bio-Rad DC蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。8%和12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離80 μg細胞總蛋白后，轉至PVDF膜(Bio-Rad)；常規封閉過夜，室溫下與抗人XIAP、GAPDH抗體(1∶1 000，Santa Cruz)孵育2 h，與辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶7 500, ImmunoResearch)孵育1 h。每次孵育后，均用含0.02% Tween 20的PBS洗脫3次，用ECL(Amersham)系統檢測信號。

2.3ATP生物熒光檢測法檢測細胞毒性 將T24T、轉染空載體T24T shRNA以及T24T shRNA-XIAP細胞，以5 000 cells/well的密度接種于96孔培養板, 設置不加藥物陰性對照，不同濃度的多西他賽藥物與細胞共同作用48 h。使用Promega公司熒光酶試劑盒(LOT# 154590)，去掉上清后，加入熒光酶底物后，熒光掃描儀(Microplate Luminometer LB 96 V)測定熒光強度，軟件分析藥物各濃度抑制率，計算IC50，并繪制藥物作用曲線，評估藥物作用。

2.4PI 染色法和流式細胞儀檢測細胞凋亡 胰酶消化并收集細胞，70%乙醇固定，4 ℃保存。600×g離心5 min，并用PBS液 (含有0.5% BSA 和0.1% Triton X-100)洗2次。加入PI染色液避光保存30 min后，用流式細胞儀(Beckman Coulter)檢測DNA含量和凋亡細胞百分數。

2018年12月11日，唐納森無錫新工廠奠基儀式在華平（無錫）智造園成功舉行。無錫新吳區領導及區黨政辦、宣傳部、經發局等各部門負責人、星洲股份公司負責人、唐納森公司董事長兼首席執行官Tod Carpenter先生、亞太區副總裁Franklin Cardenas先生、大中華區總裁畢明先生以及唐納森的重點客戶和供應商代表一同出席了奠基儀式。

2.5Western blotting檢測細胞內PARP和caspase-3蛋白裂解 蛋白轉膜后，室溫下與抗人PARP、caspace-3、GAPDH抗體孵育2 h,與辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶7 500, ImmunoResearch)孵育1 h。每次孵育后，均用含0.02% Tween 20的PBS洗脫3次，用ECL(Amersham)系統檢測信號。

3統計學處理

結 果

1shRNA-XIAP轉染腫瘤細胞后下調XIAP表達水平

將shRNA載體和shRNA-XIAP分別轉染到T24T細胞，經嘌呤霉素篩選4周后，可見明顯的陽性克隆, 繼續擴增培養, 分別獲得穩定表達shRNA-XIAP和空白載體shRNA的T24T細胞。經熒光顯微鏡下觀察，轉染后的T24T細胞內均出現穩定的GFP綠色熒光,見圖1。

Figure 1. T24T cells were stably transfected with shRNA and shRNA-XIAP plasmids, and puromycin was used as drug selection to acquire the stable expression cells. The GFP green fluorescence appeared in the cytoplasm under the fluorescence microscope (×400).

圖1shRNA載體和shRNA-XIAP分別轉染到T24T細胞后GFP的表達

轉染shRNA和shRNA-XIAP的細胞經Western blotting檢測均可見分子量為55 kD的蛋白條帶,見圖2A。經RT-PCR檢測T24T細胞均可見281 bp的XIAP擴增條帶, 但T24T shRNA-XIAP細胞以同量的RNA模板擴增后僅有微弱的顯影,見圖2B。經圖形分析軟件掃描檢測，以GADPH為內參照，T24T shRNA-XIAP組的XIAP蛋白表達較對照組T24T shRNA細胞明顯減低,見圖2C。以上結果表明轉染shRNA-XIAP后，XIAP蛋白和mRNA水平均下調。

圖2轉染shRNA-XIAP和shRNA的T24T細胞XIAP蛋白和mRNA的表達

2下調XIAP表達后增強多西他賽藥物的細胞毒性

實驗分未轉染對照組、shRNA表達質粒轉染組、shRNA-XIAP融合質粒轉染組。不同濃度的多西他賽作用細胞48 h后,檢測細胞的ATPase活力,見圖3。T24T細胞和shRNA T24T細胞之間的生長抑制率無顯著區別，其IC50分別為(8.22±1.23)nmol/L和(8.35±0.98) nmol/L。而shRNA-XIAP T24T細胞的IC50為(1.23±0.62)nmol/L，其細胞的生長抑制率較其余2組有顯著差異(P<0.01)。

圖3不同濃度的多西他賽分別預處理未轉染對照組、shRNA表達質粒轉染組和shRNA-XIAP融合質粒轉染組T24T細胞48h后細胞的ATPase活性

與shRNA T24T細胞相比較，shRNA-XIAP T24T細胞經2.5 nmol/L和5nmol/L多西他賽處理后，出現典型的凋亡形態學改變，如體積變小，細胞質濃縮等現象，而細胞的增殖也受到抑制,見圖4A。T24T shRNA-XIAP細胞組2nmol/L和5nmol/L多西他賽誘導的凋亡率分別為(41.45±6.23)%和(74.82±5.46)%, 顯著高于轉染對照空載體細胞的凋亡率[(25.34±3.81)%和(34.14±6.25)%],P<0.01,見圖4B。

4下調XIAP基因表達后促進腫瘤細胞內PARP和caspase-3蛋白的裂解

T24T shRNA-XIAP細胞的XIAP蛋白表達較T24T shRNA細胞明顯下調。與T24T shRNA細胞相比較，T24T shRNA-XIAP細胞經2.5 nmol/L和5 nmol/L多西他賽處理后，較明顯地出現了PARP和caspase-3的裂解產物——有活性的17 kD (p17)亞單位，見圖5。證實下調XIAP基因可顯著地增加細胞內PARP和caspase-3蛋白發生裂解，誘導腫瘤細胞凋亡。

討 論

泌尿系統來源的膀胱上皮腫瘤是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率呈明顯上升趨勢, 其晚期接受進一步化放療的治療效果仍不理想[2,6]。 本研究證實，通過下調膀胱癌細胞內的XIAP基因，將有助于增加化療藥物如多西他賽的細胞毒性，促進caspase-3裂解，膀胱癌細胞凋亡明顯增多，有助于提高臨床療效。同時也表明在多西他賽誘導腫瘤細胞凋亡過程中，XIAP起著重要作用。

越來越多的研究表明，有效誘導細胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細胞的重要作用機制。對細胞凋亡的抗性是腫瘤細胞耐藥性產生的新機制, 可以解釋相當一部分化療失敗的原因[7]。IAPs是細胞內一類獨特的抗凋亡蛋白家族, 包括XIAP、cIAP1、cIAP2、神經元凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP)、livin和survivin等。XIAP分子量57 kD，其基因定位于Xq25,主要由3個桿狀病毒IAP重復序列區(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat，BIR)和1個RING鋅指結構域(ring Zn finger domain)組成。XIAP的N-端有3個BIR結構域：BIR1、BIR2和BIR3[8]。體外動力學研究表明, XIAP是IAP家族里最強有力的caspase抑制物。XIAP的BIR2及BIR2前的連接區參與抑制caspase-3和caspase-7的活性, 單獨的BIR3結構域也足以能夠抑制caspase-9的活性, 這表明XIAP的不同BIR是以不同的方式抑制caspase-3和caspase-9的活性[9]。

已經有研究證實, 過表達XIAP可抑制凋亡, 提示XIAP可作為腫瘤等疾病基因治療的新靶點。本研究的結果也證實，通過抑制細胞內的XIAP表達，多西他賽誘導的caspase-3裂解明顯增加，促進腫瘤細胞凋亡。如He等[10]證實通過HtrA1(屬于絲氨酸蛋白酶家族)促進卵巢腫瘤細胞的XIAP降解，可提高順鉑所誘導的卵巢腫瘤細胞的細胞毒性。轉導反義XIAP不僅使卵巢癌細胞對順鉑誘導的細胞凋亡的敏感性增加, 而且還激活了caspase介導的鼠雙微粒體-2(murine double minute-2，MDM2)活化和p53的積聚[11]。另外在血液系統疾病中，對78名急性髓系白血病患者的研究發現, XIAP和患者存活率有直接相關性, XIAP低水平的患者比XIAP高水平者的存活時間明顯延長[12]。這些實驗結果均證實XIAP可影響化療藥物的敏感性，并影響患者的預后。

汪良等[13]報道細胞在轉染XIAP基因并使其過表達后，可導致其對化療藥物絲裂霉素的敏感性下降。另外，陰振飛等[14]證明化療藥物可下調膀胱癌細胞XIAP的表達。我們的實驗中，通過shRNA技術轉染并下調人源性膀胱癌細胞內的XIAP基因的表達，證實能顯著增降低多西他賽藥物的IC50，誘導細胞出現凋亡，促進細胞體內的PARP和原caspase-3的裂解, 與文獻報道的XIAP作用機制相符合。其結果與已有在膀胱癌中的上述研究結果相吻合。這一結果為提高膀胱癌患者化療敏感性提供新的思路, 也為進一步研究XIAP基因在誘導實體腫瘤細胞凋亡及凋亡調控途徑中的作用奠定了基礎。

Figure 4. Apoptosis of T24T shRNA and T24T shRNA-XIAP cells treated with different concentrations of docetaxel for 24 h. A: observation under phase-contrast microscope (×400). B: flow cytometry detection.

圖4不同濃度的多西他賽預處理對shRNA表達質粒轉染組和shRNA-XIAP融合質粒轉染組T24T細胞凋亡的影響

圖5T24TshRNA和T24TshRNA-XIAP細胞接受2.5nmol/L和5nmol/L多西他賽24h后PARP和caspase-3蛋白的裂解情況

同時本研究也還有不足之處。臨床上多西他賽一般是晚期膀胱癌患者的二線藥物方案，多數病人此前已接受一線含鉑方案的化療。本實驗中直接使用多西他賽，與臨床有一定距離。因此，轉染XIAP基因至腫瘤細胞后，其它含鉑類化療藥物對細胞毒性的影響還需要在今后的研究工作中得到進一步證實。細胞內其它信號轉導途徑如JNK/c-Jun和JAK/STAT的變化也有待進一步研究。

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Effectsofdown-regulationofX-linkedinhibitorofapoptosisproteingeneondocetaxel-inducedapoptosisinbladdercancercells

LU Yu1, FANG Yong2

(1HangzhouSanatoriumofNanjingMilitaryRegion,Hangzhou310007,China;2DepartmentofMedicalOncology,SirRunRunShawHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310016,China.E-mail:fyzju@sina.com)

AIM: To observe the effects of down-regulation of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) gene on the chemotherapeutic sensitivity of bladder cancer cells.METHODSThe shRNA and shRNA-XIAP were transfected into bladder cancer T24T cells. The fluorescence microscopy was used to detect the transfection effects.XIAPgene expression was detected by RT-PCR and Western blotting. Docetaxel was administrated to T24T, T24T shRNA and T24T shRNA-XIAP bladder cancer cells. ATPase methods was performed to measureinvitrocell viability. Morphological changes and apoptotic rates were determined by phase contrast microscopy and flow cytometry assay. Cellular poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) and caspase-3 protein expression and their cleavage were assayed by Western blotting.RESULTSThe fluorescence was obvious in the T24T shRNA and T24T shRNA-XIAP cells under the fluorescence microscope. Using Western blotting and RT-PCR methods, the protein and mRNA levels ofXIAPgene in T24T shRNA-XIAP cells were significantly decreased,respectively. After treated with various concentrations of docetaxel for 24 h, the IC50of T24T shRNA-XIAP cells was (1.23±0.62) nmol/L, lower than that of T24T and T24T shRNA cells, which were (8.22±1.23) and (8.35±0.98) nmol/L (P<0.01), respectively. Compared with control group, the typical morphological changes of apoptosis were observed in T24T shRNA-XIAP cells. Detected by flow cytometry assay, the apoptotic rates in shRNA-XIAP group were (41.45±6.23)% and (74.82±5.46)% after exposed to docetaxel at the concentrations of 2 nmol/L and 5 nmol/L for 24 h, which were significantly higher than that in T24T shRNA group with (25.34±3.81)% and (34.14±6.25)%, respectively (P<0.01). Compared with T24T shRNA cells, the cleavage of PARP and caspase-3 proteins in the cells transfected with shRNA-XIAP was significantly increased.CONCLUSIONXIAPgene is significantly down-regulated via shRNA-XIAP, which could increase the docetaxel-induced apoptosis and cytotoxic activity.

T24T cells; X-linked inhibitor of apoptosis protein; Docetaxel; Apoptosis

R73

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.008