雷奈酸鍶通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的表達促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞*

王 瑒， 李 正， 王小娜， 蘭愛平， 吳 文△

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫(yī)院東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080；3中山大學中山醫(yī)學院生理學教研室，廣東 廣州 510080)

1000-4718(2012)03-0404-05

2011-11-04

2011-12-08

十一五國家科技支撐項目(No. 2006BAI02B03)；廣東省科技計劃(No. 2008B060600039；No. 2009B030801261)

△通訊作者 Tel：020-83827812-70912；E-mail:wuwen1964@163.com

雷奈酸鍶通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的表達促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞*

王 瑒1,2， 李 正1,2， 王小娜1,2， 蘭愛平3， 吳 文1,2△

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫(yī)院東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080；3中山大學中山醫(yī)學院生理學教研室，廣東 廣州 510080)

目的探討雷奈酸鍶(strontium ranelate，Sr)是否可以通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)的表達而促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化為成骨細胞。方法對大鼠BMSCs進行分離、純化、培養(yǎng)及向成骨細胞的定向誘導分化，并在誘導培養(yǎng)時，根據(jù)實驗目的加入不同濃度Sr以及BMP-2的拮抗劑noggin。用酶標法檢測成骨細胞分化和功能成熟的早期標志物——堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的變化，用茜素紅染色檢測細胞鈣化水平，用Western blotting法檢測BMP-2蛋白的表達水平。結(jié)果應(yīng)用0.1～7 mmol/L Sr處理細胞7 d均可使細胞ALP活性顯著增加，其中濃度為3 mmol/L時效果最顯著；應(yīng)用3 mmol/L Sr處理細胞21 d可使細胞鈣化結(jié)節(jié)明顯增多；應(yīng)用0.1～7 mmol/L Sr處理細胞7 d后細胞內(nèi)BMP-2蛋白水平明顯增高；在Sr處理BMSCs前，應(yīng)用BMP-2拮抗劑noggin預處理細胞2 h不僅抑制Sr對BMP-2表達的上調(diào)作用，還拮抗Sr對ALP活性及鈣化結(jié)節(jié)形成的促進作用。結(jié)論上調(diào)BMP-2的表達可能是Sr促進大鼠BMSCs分化為成骨細胞的作用機制之一。

雷奈酸鍶； 骨髓間充質(zhì)干細胞； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2； 成骨細胞

雷奈酸鍶(strontium ranelate，Sr)是由法國Servier公司研制開發(fā)的一類新型抗骨質(zhì)疏松藥物，是第一種被稱為具有雙重治療作用——促進骨形成并抑制骨吸收的新藥，主要用于治療和預防絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥以降低椎體和髖部骨折的危險性。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)能夠保持其干細胞的表型而引起多向分化，定向誘導其向成骨分化可為研究骨組織工程、骨折修復和骨質(zhì)疏松等難題提供理論基礎(chǔ)。有學者報道Sr可促進小鼠BMSCs和人BMSCs[1-2]向成骨細胞分化，能增加細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性、I型膠原、骨鈣素等成骨細胞標志的表達，同時也能促進細胞的鈣化。Caverzasio等[3]對Sr促進成骨細胞系增殖的機制進行研究，發(fā)現(xiàn)Sr能夠通過兩種獨特的細胞學機制增加成骨細胞系的復制：(1)直接與鈣感應(yīng)受體(calcium-sensing receptor,CaSR)相互作用，觸發(fā)絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)p38等信號活化；(2)通過釋放一種自分泌生長因子來促進成骨細胞的增殖，但其具體機制尚不明確。Choudhary等[1]發(fā)現(xiàn)Sr誘導小鼠的MSCs向成骨細胞分化與環(huán)氧化酶 2和前列腺素E2的介導有關(guān)；Fromigué等[4]認為激活活化T細胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)以及下游經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt信號通路(Wnt signaling pathways)對雷奈酸鍶誘導的成骨細胞復制和分化均有影響。

研究人員對于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)的興趣可以追溯到上世紀60年代，Marshall Urist將脫鈣骨基質(zhì)移植到肌肉內(nèi)后引起了異位成骨[5]。BMPs通過協(xié)調(diào)細胞分化、增殖、生長和凋亡，在各種組織器官如牙齒、腎臟、前列腺、乳腺、皮膚、毛發(fā)、肌肉、心臟和神經(jīng)等的不同發(fā)育過程以及體內(nèi)平衡中發(fā)揮了重要作用[6]。BMPs在調(diào)節(jié)成骨細胞分化以及其后的骨形成過程中也起了重要作用。在人類和動物的體外模型中，已經(jīng)證實BMPs可以刺激干細胞分化為成骨細胞[7-8]，其中BMP-2是現(xiàn)在被研究最多的一種。而在Sr促進BMSCs分化為成骨細胞的過程中，是否存在著BMP-2的作用還未見報道。為此，本實驗觀察在Sr刺激大鼠BMSCs分化為成骨細胞過程中對BMP-2表達的影響及其作用，為探討Sr可能的促成骨機制提供新穎的實驗資料。

材 料 和 方 法

1主要材料

4周齡雄性SD大鼠購自中山大學實驗動物中心；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；青霉素、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸購自Sigma；雷奈酸鍶干混懸劑由法國Servier公司惠贈；堿性磷酸酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；細胞茜素紅(alizarin red S)鈣染色試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；BMP-2抗體購自Bioworld；noggin購自R&D。

2主要方法

2.1大鼠BMSCs的獲取 取4周齡雄性SD大鼠1只，頸椎脫臼法處死后用75%乙醇浸泡5 min，在無菌條件下分離出兩側(cè)股骨及脛骨，剔除表面的肌肉、筋膜等組織，剪去股骨近端和脛骨遠端，暴露骨髓腔，用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM低糖完全培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入2 mL上述DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，種植于培養(yǎng)瓶中并吹打混勻，標記為原代P0，置于37 ℃、5% CO2、80%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換新鮮培養(yǎng)液以去除未貼壁細胞和各種雜質(zhì)，加入5 mL新鮮培養(yǎng)液。此后每隔2～3 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況，直至細胞接近80%～90%融合時進行傳代。此后每隔3～4 d傳代1次。

2.2BMSCs的成骨分化 選取第3～5代BMSCs為研究對象，根據(jù)不同實驗需要將細胞種植于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入成骨誘導液(含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素及100 mg/L鏈霉素、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸的DMEM低糖培養(yǎng)基)培養(yǎng)。

2.3ALP活性檢測 選取第3代細胞，以約1×108/L的密度接種于24孔板，各實驗組給予不同處理因素后，于第7 d采用酶標法檢測ALP活性。檢測時將細胞收集后以0.2% Triton X-100裂解液及反復凍融法充分裂解，裂解后用PBS洗2遍，12 000 r/min離心10 min，取上清液按試劑盒說明書進行操作，于酶標儀520nm波長處測定結(jié)果。

2.4茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色 選取第3代細胞，接種于24 mm×24 mm蓋玻片上，蓋玻片預先置于6孔板中。各實驗組給予不同處理因素后，于第21 d按照細胞茜素紅鈣染色試劑盒說明書對樣本進行固定、染色及澄清處理，倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況，每組取5個樣本，每樣本隨機取1個視野(×100)，比較各組間的差異。

2.5Western blotting法檢測BMP-2蛋白表達水平 選取第3代細胞，接種于60 mm 培養(yǎng)皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，用預冷的PBS洗2遍，加入細胞裂解液，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進行蛋白定量。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，隨后加入BMP-2抗體(1∶1 000),4 ℃過夜，用TBST洗3次，每次10min，加入Ⅱ抗(1∶2 500)孵育1.5 h，再用TBST洗3次，每次10 min。將膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析結(jié)果。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1Sr增加BMSCs的ALP活性

0 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L及7 mmol/L Sr處理細胞7 d，各實驗組與對照組相比，ALP活性均有所增加， 當Sr濃度為0.1 mmol/L時，與對照組相比，ALP活性即有顯著增加(P<0.05)，當Sr濃度增加至3 mmol/L時，ALP活性增至最大，而5 mmol/L及7 mmol/L時，ALP活性增加幅度降低。可認為在0.1～7 mmol/L濃度范圍內(nèi)，Sr對BMSCs向成骨分化的促進作用具有一定的劑量依賴性，見表1。

表1不同濃度Sr對ALP活性的影響

GroupActivityofALPControl0.153±0.007Sr(0.1mmol/L)0.169±0.005#Sr(1mmol/L)0.279±0.012##Sr(3mmol/L)0.304±0.007##Sr(5mmol/L)0.266±0.009##Sr(7mmol/L)0.187±0.013##

#P<0.05,##P<0.01vscontrol.

2Sr促進BMSCs的鈣結(jié)節(jié)生成

圖1顯示，3 mmol/L Sr處理BMSCs 21 d，與對照組相比細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)生成明顯增多，見圖1。

圖1Sr促進BMSCs鈣結(jié)節(jié)形成

3Sr上調(diào)BMSCs的BMP-2表達

圖2A顯示，0.1 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L及7 mmol/L Sr處理BMSCs 7 d后，與對照組相比，細胞內(nèi)BMP-2表達均明顯升高，Sr的濃度為1 mmol/L 時BMP-2表達水平達到最高值，Sr的濃度為7 mmol/L時，BMP-2表達的上升幅度明顯下降，但仍明顯高于對照組(P<0.05),呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性；圖2B顯示，1 mmol/L Sr分別處理BMSCs 1 d、3 d、5 d、7 d及10 d后，與對照組相比，細胞內(nèi)BMP-2表達均明顯升高，在1～7 d的時間范圍內(nèi)，Sr呈時間依賴性地促進BMP-2表達，Sr處理BMSCs 7 d時，BMP-2表達水平達到高峰，處理10 d時，BMP-2表達水平顯著下降，但仍明顯高于對照組(P<0.05)，見圖2。

4BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對BMP-2表達的上調(diào)作用

圖3顯示，1 mmol/L Sr處理BMSCs 7 d后，與對照組相比，細胞內(nèi)BMP-2表達明顯增加(P<0.01),在Sr處理BMSCs前，給予100 μg/L noggin預處理2 h后，細胞內(nèi)BMP-2表達明顯下降。100 μg/L noggin或PBS本身對BMP-2的基礎(chǔ)表達無明顯影響，見圖3。

5BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對ALP活性的促進作用

3 mmol/L Sr處理BMSCs 7 d后，與對照組相比，細胞內(nèi)ALP活性顯著增加(P<0.05)，在Sr處理細胞前，給予100 μg/L noggin預處理2 h后，細胞內(nèi)ALP活性顯著降低(P<0.05)。Noggin(100 μg/L)或PBS本身對ALP活性無明顯影響，見圖4。

6BMP-2拮抗劑noggin抑制Sr對鈣結(jié)節(jié)生成的促進作用

圖5顯示，3 mmol/L Sr處理BMSCs 21 d后，與對照組相比，細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增加，在Sr處理細胞前，給予100 μg/L noggin預處理2 h后，細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少。Noggin (100 μg/L)或PBS本身對鈣結(jié)節(jié)形成無明顯影響,見圖5。

圖2Sr對BMSCsBMP-2表達的影響

討 論

Urist[5]于上世紀60年代最早利用脫鈣骨基質(zhì)在肌肉內(nèi)誘發(fā)異位成骨，這一實驗結(jié)果提示在骨基質(zhì)中可能含有一種活性蛋白質(zhì), 這種活性蛋白質(zhì)可以在骨骼和骨骼以外的部位誘生出骨和軟骨組織,它后來被命名為BMPs。BMPs是一組具有類似高度保守結(jié)構(gòu)的的功能強大的糖蛋白，除BMP-1屬于金屬肽鏈內(nèi)切酶家族(the astacin family of metallo-endopeptidases)外，其余均屬于轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族。迄今為止，在人類胚胎發(fā)生、骨骼形成、造血生成及神經(jīng)發(fā)育過程中，已經(jīng)鑒定出骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族超過20種具有各種不同作用的成員[9]。BMP-2已經(jīng)成為BMPs家族里被研究最廣的成員，其功能主要是從骨折愈合、骨質(zhì)缺損以及一些脊柱融合模型中分析得出[10]。已有臨床前研究和臨床研究表明，BMP-2可以在骨缺損、非連續(xù)骨折、脊柱融合、骨質(zhì)疏松癥和根管手術(shù)中使用[11]。Govender等[12]報道一項包括450例受試者的前瞻性、隨機、對照、單盲研究結(jié)果，接受包含重組BMP-2治療的試驗組獲得了更快的骨折愈合(P<0.01)和更少的感染發(fā)生率(P<0.05)。重組人BMP-2是唯一在脛骨骨折和脊柱融合應(yīng)用方面具有完整前瞻、隨機臨床試驗的BMP[13]，并于2002年7月2日被美國FDA批準作為一種骨移植替代物用于脊柱融合[14]。此外，BMP-2在腫瘤學領(lǐng)域也發(fā)揮了它特有的作用[15]。

圖3BMP-2抑制劑noggin預處理拮抗Sr對BMP-2表達的促進作用

圖4BMP-2抑制劑noggin預處理阻斷Sr對ALP活性的促進作用

Figure 5. Preconditioning with BMP-2 inhibitor noggin inhibited Sr-induced mineralization in BMSCs(×100).A:control;B:Sr;C:Sr+noggin;D:noggin;E:PBS.

圖5BMP-2抑制劑noggin預處理阻斷Sr對鈣結(jié)節(jié)生成的促進作用

本研究證實了Sr可促進BMSCs分化為成骨細胞，這與國內(nèi)外很多研究結(jié)論相一致[2-3]。重要的是本研究首次證實，在BMSCs分化為成骨細胞的過程中，Sr上調(diào)了BMP-2的表達，而且BMP-2的拮抗劑noggin不僅拮抗Sr對BMP-2表達的上調(diào)作用，還抑制Sr的促成骨作用，這提示上調(diào)的BMP-2介導了Sr對BMSCs分化為成骨細胞的促進作用，為深入闡明鍶鹽抗骨質(zhì)疏松的機制提供了新的實驗依據(jù)，也為防治骨質(zhì)疏松癥以及各種骨科疾病新藥的研發(fā)提供了新的作用靶點。

[1] Choudhary S, Halbout P, Alander C, et al. Strontium ranelate promotes osteoblastic differentiation and mineralization of murine bone marrow stromal cells: involvement of prostaglandins[J]. J Bone Miner Res,2007,22(7):1002-1010.

[2] Sila-Asna M, Bunyaratvej A, Maeda S, et al. Osteoblast differentiation and bone formation gene expression in strontium-inducing bone marrow mesenchymal stem cell[J]. Kobe J Med Sci,2007,53(1-2):25-35.

[3] Caverzasio J. Strontium ranelate promotes osteoblastic cell replication through at least two different mechanisms[J]. Bone,2008,42(6):1131-1136.

[5] Urist MR.Bone: formation by autoinduction[J]. Science,1965,150(698):893-899.

[6] Ye L, Mason MD, Jiang WG.Bone morphogenetic protein and bone metastasis, implication and therapeutic potential[J].Front Biosci, 2011,1(16):865-897.

[7] Reddi AH.Bone morphogenetic proteins: from basic science to clinical applications[J].J Bone Joint Surg Am,2001,83-A Supp 1(Pt 1):S1-S6.

[8] Gautschi OP, Frey SP, Zellweger R.Bone morphogenetic proteins in clinical applications[J].ANZ J Surg,2007,77(8):626-631.

[9] Bragdon B, Moseychuk O, Saldanha S,et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review[J]. Cell Signal,2011,23(4):609-620.

[10]Valdes MA, Thakur NA, Namdari S,et al. Recombinant bone morphogenic protein-2 in orthopaedic surgery: a review[J].Arch Orthop Trauma Surg,2009,129(12):1651-1657.

[11]Chen D, Zhao M, Mundy GR.Bone morphogenetic proteins[J].Growth Factors,2004,22(4):233-241.

[12]Govender S, Csimma C, Genant HK, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 for treatment of open tibial fractures: a prospective, controlled, randomized study of four hundred and fifty patients[J]. Bone Joint Surg Am,2002,84-A(12):2123-2134.

[13]Khan SN, Lane JM.The use of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) in orthopaedic applications[J].Expert Opin Biol Ther,2004,4(5):741-748.

[14]McKay B.Local sustained delivery of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2)[J].Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc,2009,2009:236-237.

[15] 黃培德, 黃飛程, 陳 陽, 等. 重組人骨形成蛋白-2提高人乳腺癌細胞MCF-7的遷移性[J]. 中國病理生理雜志, 2010,26(5):931-936.

Strontiumranelatepromotesdifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcellstoosteoblastsbyincreasingexpressionofbonemorphogeneticprotein2

WANG Yang1, 2, LI Zheng1, 2, WANG Xiao-na1, 2, LAN Ai-ping3, WU Wen1,2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510080,China;2DepartmentofEndocrinology,EastWardofGuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China;3DepartmentofPhysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:wuwen1964@163.com)

AIM: To explore whether strontium ranelate (Sr) promotes differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) to osteoblasts by increasing the expression of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2).METHODSRat BMSCs were isolated, purified and cultured, then were induced to differentiate into osteoblasts. The cells were treated with different concentrations of Sr or noggin (an inhibitor of BMP-2) according to the experimental purposes. The activity of alkaline phosphatase (ALP) was measured by colorimetry. Mineralized nodules were measured by alizarin red staining. The expression of BMP-2 was detected by Western blotting.RESULTSTreatment with Sr at concentrations of 0.1 mmol/L to 7 mmol/L for 7 d obviously increased the activity of ALP,and Sr at concentration of 3 mmol/L produced the maximum effect. Exposure of the cells to Sr at concentration of 3 mmol/L for 21 d significantly increased mineralized nodules. Exposure of the cells to Sr at concentrations of 0.1 mmol/L to 7 mmol/L for 7 d markedly increased the expression of BMP-2. Preconditioning with noggin at concentration of 100 μg/L for 2 h not only inhibited Sr-induced expression of BMP-2, but also antagonized the increase in the activity of ALP and mineralization induced by Sr in BMSCs.CONCLUSIONUp-regulation of the expression of BMP-2 may be one of the mechanisms by which Sr promotes differentiation of rat BMSCs to osteoblasts.

Strontium ranelate; Bone marrow mesenchymal stem cells; Bone morphogenetic protein 2; Osteoblasts

R589

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.004