應用酵母雙雜交技術篩選與RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白*

王順清， 鐘雯婷， 鄧 暉， 毛 平， 許艷麗

(廣州醫學院附屬市一人民醫院 1血液科，2輸血科， 廣東 廣州 510180)

1000-4718(2012)04-0730-04

2011-03-31

2012-03-08

國家自然科學基金資助項目(No.30871101)；廣州市醫藥衛生科技重點資助項目(No.2006-ZDi-02)

△通訊作者 Tel：020-81048386；E-mail：drwangshq@medmail.com.cn

應用酵母雙雜交技術篩選與RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白*

王順清1△， 鐘雯婷1， 鄧 暉2， 毛 平1， 許艷麗1

(廣州醫學院附屬市一人民醫院1血液科，2輸血科， 廣東 廣州 510180)

目的應用酵母雙雜交技術篩選小鼠巨噬細胞中與核因子κB受體激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白，以探尋RANKL/RANK系統中介導破骨細胞形成的RANK下游新信號轉導蛋白。方法應用GAL4酵母雙雜交系統3，構建僅包含編碼新基序535IVVY538的一小段RANK的cDNA片段為誘餌質粒pGBKT7-IVVY，并與巨噬細胞cDNA文庫質粒pGADT7-library共轉化AH109酵母，篩選與RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白，通過回復性雜交實驗驗證其可靠性，并對陽性克隆進行測序和基因同源性分析。結果篩選出4個可能與IVVY基序有相互作用的蛋白，包括Ring1和YY1結合蛋白(RYBP)、ATP結合盒、E2F轉錄因子和熱休克蛋白8，其中表達RYBP的陽性克隆出現頻率高、速度快。結論應用酵母雙雜交技術成功地篩選出4個可能與IVVY基序相互作用的候選蛋白，其中RYBP可能性最大。

酵母雙雜交； RANKL/RANK系統； IVVY基序； 相互作用蛋白質

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)占血液系統惡性腫瘤的10%～15%，其突出的臨床特點之一就是進行性骨質破壞，稱之為骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)，其治療方法和療效均有限，是影響MM患者生存質量和預后的重要因素之一。研究發現骨髓瘤患者核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)表達異常增高，致使RANKL與它的受體—核因子κB受體激活因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK)組成的RANKL/RANK信號轉導系統過度激活，促使大量巨噬細胞分化形成破骨細胞，這種破骨細胞生成過多且功能亢進在骨髓瘤骨病發生、發展中起關鍵作用，因此抑制RANKL/RANK 信號轉導途徑從而抑制破骨細胞的形成及其破骨功能是治療骨髓瘤骨病最有效方法之一[1]。深入研究RANKL/RANK 信號轉導途徑及其轉導蛋白，針對 RANKL/RANK 信號轉導途徑中各信號蛋白來研究、開發新的 MBD 治療藥物是研究的熱點之一。我們前期的研究在RANK蛋白上鑒定出一個全新的基序——535IVVY538，它是破骨細胞形成所必需的位點，且介導了一條新的破骨細胞形成所必需的信號轉導途徑[2]。為進一步研究此信號轉導途徑，我們已成功構建出高質量的適合酵母雙雜交實驗的小鼠巨噬細胞cDNA 文庫[3]，本研究旨在利用酵母雙雜交技術篩選和找出與IVVY基序相互作用的RANK下游信號轉導蛋白。

材 料 和 方 法

1材料

1.1載體與菌株 大腸桿菌DH5α購自Invitrogen，酵母AH109 菌株、pGBKT7 和pGADT7 質粒均購自Clontech。

1.2誘餌質粒和cDNA文庫 本課題組已成功構建高質量小鼠巨噬細胞cDNA酵母表達文庫pGADT7 - library, 稱AD/library。PCR擴增包含編碼新基序535IVVY538的一小段小鼠RANK的cDNA片段(編碼498～556號共59個氨基酸)，克隆到pGBKT7載體，構建出誘餌質粒pGBKT7-IVVY，稱DNA-BD/bait。

1.3主要試劑 酵母雙雜交系統(MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3，包含pGBKT7 和pGADT7 質粒等)、酵母質粒提取試劑盒(Easy Yeast Plasmid Isolation Kit)、酵母轉化系統(YeastmakerTMYeast Transformation System 2)、酵母YPDA培養基、SD/-Trp 、SD/-Leu、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、X-α-半乳糖苷酶(X-α-galactosidase, X-α-Gal)、抗c-Myc和HA-Tag抗體等購自Clontech。大腸桿菌質粒提取試劑盒購自Qiagen。限制性內切酶和連接酶等購自NEB。其它試劑購自Sigma。

2方法

2.1AD/library及DNA-BD/bait自激活活性檢測 按照Clontech公司的說明書，利用標準PEG/LiAc方法分別轉化誘餌質粒DNA-BD/bait和巨噬細胞cDNA文庫質粒AD/library至酵母菌AH109，轉化子再分別鋪皿于SD /-Trp/X-α-Gal 和SD /-Leu/X-α-Gal培養基上，30 ℃培養3～4 d，通過觀察酵母克隆是否生長、克隆大小及菌落顏色的變化，判斷誘餌和文庫質粒是否有自激活活性。同時用載體pCL1和pGBKT7-53質粒分別接種于SD /-Leu/X-α-Gal和SD /-Trp/X-α-Gal平板作為陽性和陰性對照組。

2.2AD/library及DNA-BD/bait在酵母中蛋白表達的檢測 分別挑取一個轉化了AD/library和DNA-BD/bait的酵母克隆接種于SD/-Leu和SD/-Trp液體培養基，于30 ℃振蕩培養、擴增后低溫低速離心收集，用Urea/SDS方法提取蛋白質。用抗c-Myc和HA-Tag單抗行Western blotting，檢測AD/library及DNA-BD/bait質粒在酵母中的蛋白質表達情況；未轉化的酵母AH109為陰性對照。

2.3AD/library及DNA-BD/bait共轉化酵母進行篩庫 利用Clontech公司YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒，按說明書將AD/library及DNA-BD/bait共轉化AH109酵母感受態細胞，30 ℃培養90 min后，將菌液涂布于高選擇強度的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上，30 ℃培養、觀察7 d，篩選藍色的陽性克隆。

2.4假陽性克隆的剔除及候選陽性質粒與誘餌質粒在酵母內相互作用的驗證 挑取所有單菌落的陽性克隆，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上反復、連續傳代3次，3次均呈陽性的克隆再接種于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液體培養基，用酵母質粒提取試劑盒(Easy Yeast Plasmid Isolation Kit)提取酵母內質粒，轉化至大腸桿菌DH5α中擴增，用Qiagen公司試劑盒抽提、純化大腸桿菌質粒。然后，所獲得的候選陽性質粒一對一與誘餌質粒DNA-BD/bait共轉化酵母菌AH109，轉化產物涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板, 不能生長或生長菌落呈白斑者作為假陽性剔除。這樣也在酵母內進一步驗證了所篩選出的陽性質粒與誘餌質粒的相互作用。

2.5陽性克隆的鑒定、分析 上述最后篩選出來的陽性質粒，一方面用限制性內切酶BsrGⅠ酶切、1%瓊脂糖凝膠中電泳，根據片段大小進行分類；另一方面將陽性質粒進行測序, 在GenBank中進行同源性比對分析。

結 果

1AD/library及DNA-BD/bait自激活活性檢測

如圖1所示，陽性對照組pCL1質粒的轉化子在SD/-Leu/X-α-Gal平板見藍色克隆生長，陰性對照pGBKT7-53質粒的轉化子在SD/-Trp/X-α-Gal平板見白色克隆生長；AD/library及DNA-BD/bait質粒的轉化子分別在SD/-Leu/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal平板上出現白色克隆生長；而且4種轉化子的克隆生長良好，直徑>2 mm，說明AD/library及DNA-BD/bait表達的蛋白無自激活活性。

Figure 1. Detection of autonomous activation of AD/library and DNA-BD/bait.Only positive control pCL1 showed blue colonies. Like negative control pGBKT7-53, AD/library and DNA-BD/bait showed white colonies.

圖1AD/library及DNA-BD/bait自激活活性檢測

2AD/library及DNA-BD/bait在酵母中蛋白表達的檢測

從AD/library及DNA-BD/bait的克隆轉化菌提取蛋白質，經Western blotting分析，分別檢測到相應的HA和c-Myc標記的融合蛋白，見圖2。

Figure 2. Detection of the expression of HA- and c-Myc- fusing protein in yeast.

圖2酵母中HA和c-Myc融合蛋白表達的檢測

3酵母的共轉化篩庫和候選陽性質粒的提取

我們共進行了3輪AD/library和DNA-BD/bait的酵母

AH109共轉化，直接在高選擇強度的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板上進行篩庫實驗，總共篩選出25個陽性的藍色克隆，將這25個克隆反復3次在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上接種傳代得到18個陽性的藍色克隆。提取這18個陽性酵母克隆中的質粒，并轉化到大腸桿菌DH5α中擴增后提取和純化出來，此過程中丟失4個陽性克隆的質粒，最后獲得14個候選的陽性質粒，編號為1～14。

4候選陽性質粒與DNA-BD/bait相互作用的驗證

將篩選出的14個候選陽性質粒一對一與DNA-BD/bait共轉化AH109 酵母感受態，菌液鋪于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上篩選。有4個沒有克隆形成，為假陽性克隆，最后獲得10個陽性的候選質粒，見圖3。

Figure 3. Verification of the interaction between candidate positive plasmids and DNA-BD/bait.No clone formed when 4 of all 14 candidate plasmids (No.6,12,13,14) and DNA-BD/bait were used to co-transform yeast strain AH109.They were false positive clones.

圖3候選陽性質粒與DNA-BD/bait相互作用的驗證

5候選質粒的分析和鑒定

候選質粒用BsrGⅠ酶切后電泳分析，其中6個質粒有相似的插入片段,另有2個質粒有相似大小的插入片段，其余2個各不相同。對這10個質粒的插入片段行DNA測序，在GenBank中進行同源性分析，結果與酶切分析一致，如表1所示，其中6個DNA序列完全一樣，編碼Ring1和YY1結合蛋白(Ring1 and YY1 binding protein，RYBP)；有2個DNA序列完全一樣，編碼ATP結合盒(ATP-binding cassette)；其余2個分別為編碼E2F轉錄因子(E2F transcription factor)和熱休克蛋白8 (heat-shock protein 8)的基因。而且，檢查實驗結果也發現，表達RYBP蛋白的陽性克隆出現最快。

表1 候選質粒的同源性分析

討 論

酵母雙雜交系統是Fields等[4]建立的一種檢測蛋白-蛋白相互作用實驗技術，其基本原理是：典型的真核生物轉錄因子，如GAL4、GCN4等含有2個不同的結構域：DNA結合結構域(DNA-binding domain，BD)和轉錄激活結構域(transcription-activating domain，AD)，二者可以從核酸一級結構上分開而獨立表達出有功能的結構域，這2個結構域只要在同一細胞內能夠彼此靠近，就可以激活下游報告基因的表達。因此將誘餌蛋白融合到一個結構域上(如BD-bait)，而將表達文庫構建到另一個結構域上(如AD-library)，就可以篩選到與誘餌蛋白相互作用的蛋白。酵母雙雜交技術是目前應用較多的釣取與已知蛋白直接相互作用分子的方法。

RANKL/RANK系統涉及多種生理功能，信號轉導復雜。本研究是要在鑒定出的RANK蛋白上介導破骨細胞形成所必需新基序535IVVY538的基礎上，進一步研究此基序介導的新的信號轉導途徑，目的是要篩選直接與IVVY基序相互作用的下游信號轉導蛋白，因此只選擇了RANK基因上編碼包括IVVY基序在內的一段cDNA片段(編碼498～556號氨基酸)來構建誘餌質粒，這樣誘餌蛋白只是包括IVVY在內的59個氨基酸，可以盡量減少RANK蛋白上其它的結構(如Motif 1～3等等)的干擾，使酵母雙雜交所篩選到的候選蛋白更能針對于IVVY基序，有利于減少整個實驗過程及結果分析的復雜性。

酵母雙雜交實驗中所用的cDNA文庫是我們專門為此研究構建的[3]，來源于破骨細胞的前體細胞——巨噬細胞的mRNA，必然存在著豐富的介導巨噬細胞向破骨細胞轉化的全套信號轉導蛋白基因；文庫平均滴度為3.24×109cfu/L，總容量達3.89×107cfu，平均插入片段為2.27 kb，重組率達95.83%，質量高，為酵母雙雜交實驗打下堅實的基礎。

我們直接利用高選擇強度SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal進行篩選，僅經過3輪的篩庫，就得到10個陽性的候選質粒，經測序和同源比對分析，篩出4個可能與IVVY基序相互作用的候選蛋白。其中有6個是同一個基因，表達RYBP蛋白，它不僅出現的幾率最高，而且實驗中發現其陽性克”隆出現最快，提示它是可能性最大、相互作用最強的候選蛋白，下一步將首先展開重點研究，篩選到的其它候選蛋白也需進一步分析和驗證。

RYBP是一個轉錄抑制因子，屬PcG(polycomb Group)蛋白家族成員之一，可與PcG蛋白復合體的其它成分如Ring1、M33以及其它轉錄因子如YY1、E2F等相互作用，通過PcG蛋白依賴性的表觀遺傳學機制，如啟動子區CpG島甲基化、組蛋白修飾(H3甲基化、H2A泛素化)等，調節下游基因的轉錄活性，發揮多種生理或病理功能。RYBP基因敲除小鼠在胚胎期就死亡，RYBP表達缺陷會導致眼睛和中樞系統發育異常[5]。研究還證實RYBP參與細胞的增殖、分化以及凋亡等[6-7]，與生物體生長發育、腫瘤發生發展等密切相關。本研究發現了RYBP可能通過IVVY基序與RANK蛋白相互作用，介導破骨細胞生成，這為進一步研究RANKL/RANK信號系統介導破骨細胞形成的生理機制提供了一個切入點。但RYBP與RANK之間相互作用的具體途徑、機制等，有待于進一步驗證和研究。

(致謝：本研究在美國阿拉伯馬大學伯明翰分校馮旭副教授的悉心指導和大力支持下完成，深表感謝！)

[1] Sezer O. Myeloma bone disease: recent advances in biology, diagnosis, and treatment [J]. Oncologist，2009，14(3):276-283.

[2] Xu D, Wang S, Liu W, et al. A novel receptor activator of NF-κB (RANK) cytoplasmic motif plays an essential role in osteoclastogenesis by committing macrophages to the osteoclast lineage [J]. J Biol Chem, 2006, 281(8):4678-4690.

[3] 王順清，林蔡弟，毛 平,等. 小鼠巨噬細胞cDNA酵母表達文庫的構建與鑒定[J]. 中華生物醫學工程雜志， 2010，16(4)：292-297.

[4] Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein- protein interactions [J]. Nature, 1989, 340(6230): 245-246.

[5] Pirity MK,Wang WL,Wolf LV, et al. Rybp, a polycomb complex-associated protein, is required for mouse eye development[J].BMC Dev Biol, 2007, 7:39.

[6] González I, Aparicio R,Busturia A. Functional characterization of thedRYBPgene in Drosophila[J]. Genetics, 2008,179(3):1373-1388.

[7] Novak RL, Phillips AC. Adenoviral-mediated Rybp expression promotes tumor cell-specific apoptosis[J]. Cancer Gene Ther,2008,15(11):713-722.

ScreeningofproteinsinteractingwithIVVYmotifofRANKproteinbyyeasttwo-hybridtechnique

WANG Shun-qing1, ZHONG Wen-ting1, DENG Hui2, MAO Ping1, XU Yan-li1

(1DepartmentofHematology,2DepartmentofBloodTransfusion,GuangzhouFirstMunicipalPeople’sHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510180,China.E-mail:drwangshq@medmail.com.cn)

AIM: To explore the new downstream signal transduction proteins mediating osteoclast formation in RANKL/RANK system by the technique of yeast two-hybrid in mouse macrophages.METHODSUsing MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3, a small piece of RANK cDNA which harbored a cDNA fragment coding a novel motif,535IVVY5381， was sub-cloned into pGBKT7 to construct the bait plasmid (named as pGBKT7-IVVY). The yeast strain AH109 co-transformed with pGBKT7-IVVY and a yeast expression macrophage cDNA library (pGADT7-library) was used to screen the proteins interacting with IVVY motif of RANK. Repeated yeast two-hybridization experiments were conducted to exclude the false positive clones and to verify the interactants. The positive clones were sequenced and analyzed with BLAST in NCBI.RESULTSFour candidate proteins probably interacting with IVVY were obtained, including Ring1 and YY1 binding protein (RYBP), ATP-binding cassette, E2F transcription factor and heat-shock protein 8. The clone coding RYBP was screened out frequently and quickly.CONCLUSIONFour candidate interactive proteins are successfully identified using yeast two-hybrid screening. RYBP is the most probable one.

Yeast two-hybrid; RANKL/RANK system; IVVY motif; Interactive protein

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.027