高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定雙黃消炎片中黃芩苷和黃芩素含量

徐占方，陳立柱，姜雪敏，孫 菲

(黑龍江省雞西市藥品檢驗(yàn)所，黑龍江 雞西 158100)

雙黃消炎片由三顆針、黃芩兩味中藥組方，具有消炎之功效[1]，可用于咽喉痛、腹瀉、痢疾、慢性痢疾等癥，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有顯微鑒別和黃酮類化合物的定性鑒別，無對(duì)黃芩主要成分的定量檢測(cè)，無法有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量。黃芩質(zhì)量好壞直接影響藥品的療效，黃芩的主要成分有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素[2]。對(duì)雙黃消炎片中黃芩苷的高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定已有報(bào)道[3-5]，但僅用黃芩苷一種成分的含量不能全面地反映黃芩的質(zhì)量。筆者建立了可同時(shí)測(cè)定雙黃消炎片中黃芩苷、黃芩素兩種主要成分含量的高效液相色譜法，報(bào)道如下。

1 儀器和試藥

HP1100型高效液相色譜儀，HP1100型工作站(自動(dòng)進(jìn)樣，紫外檢測(cè)器);Sartorius電子天平;KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器;TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)為110715-200815，含量為95.2%)，黃芩素對(duì)照品(批號(hào)為111595-200604)，均購自中國藥品生物制品檢定所;雙黃消炎片(市售樣品3批，批號(hào)分別為20100924和20100305，通化萬通藥業(yè)有限公司;批號(hào)為20080701，吉林省俊宏藥業(yè)有限公司);其他試劑均為色譜純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);以甲醇(A)-0.4%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相梯度洗脫，40%A(0 min)，80%A(40 min)，40%A(60 min);檢測(cè)波長:277 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10μL;柱溫:30℃。在此條件下，理論板數(shù)不低于5 000，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取樣品適量(約相當(dāng)于平均片重)，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇40 mL，超聲提取40 min，放置至室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過，精密吸取5 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。分別精密稱取經(jīng)P2O5干燥過夜的黃芩苷對(duì)照品29.82 mg和黃芩素對(duì)照品10.61 mg，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，用甲醇稀釋至刻度，濾過，作為對(duì)照品貯備液。按雙黃消炎片的處方、制法項(xiàng)下不加黃芩粉末，制備陰性樣品，按供試品溶液制備的方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密量取黃芩苷、黃芩素對(duì)照品貯備液1.0和0.5 mL，置同一10 mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣 1，2.5，5，10，15，20，25μL，以峰面積 Y對(duì)質(zhì)量濃度 X(μg/mL)進(jìn)行回歸分析。黃芩苷回歸方程為 Y=37.45X+11.84，r=1.000 0(n=7)，黃芩苷質(zhì)量濃度在5.678～142.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好;黃芩素回歸方程為 Y=61.55X-1.691，r=1.000 0(n=7)，黃芩素質(zhì)量濃度在2.122～53.05μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取對(duì)照品溶液(含黃芩苷56.78μg/mL，黃芩素21.22μg/ml)，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果黃芩苷和黃芩素峰面積值的RSD分別為0.1%和0.3%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，8，12，16，24 h時(shí)重復(fù)進(jìn)樣。結(jié)果黃芩苷和黃芩素峰面積的 RSD分別為0.6%和0.7%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):分別精密稱取同一樣品(批號(hào)為20080701)5份，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果黃芩苷和黃芩素平均含量分別為29.53 mg/g和9.053 mg/g，RSD分別1.2%和1.1%(n=5)，表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品(批號(hào)為20080701，平均片重為0.401 2 g)約0.2 g共6份，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液(含黃芩苷2 917μg/mL和黃芩素 909 μg/mL)2.4，2.4，2.0，2.0，1.6，1.6 mL，加 70%乙醇溶液適量，超聲40 min，放至室溫，用70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取5 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜濾過，進(jìn)樣10μL，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取本品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于平均片重)，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按擬訂的色譜條件進(jìn)樣10μL，按峰面積外標(biāo)法測(cè)定含量。結(jié)果見表2。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

分別取黃芩苷和黃芩素對(duì)照品適量，用流動(dòng)相稀釋到一定的質(zhì)量濃度，照紫外分光光度法，在200～700 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果黃芩苷、黃芩素的最大吸收波長分別是279 nm和277 nm，但在277 nm處黃芩苷和黃芩素分離效果好，故將測(cè)定波長確定為277 nm。

為在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)獲得滿意的分離效果，故采用梯度洗脫，色譜柱選用250 mm的長柱。流動(dòng)相開始采用磷酸鹽緩沖液-乙腈，黃芩苷和黃芩素分離效果不理想，采用甲醇和磷酸溶液定，梯度洗脫后取得了較好的分離效果。

在試驗(yàn)過程中，考察了單純用甲醇超聲30 min提取、70%乙醇超聲30 min提取、70%乙醇加熱回流3 h提取的效果，結(jié)果表明，用甲醇超聲提取黃芩苷提取不完全，加熱回流方法雖提取得徹底但比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，最終選用70%乙醇超聲40 min提取。幾種方法提取黃芩苷的差異較大。

本品的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制水平較低，僅對(duì)雙黃消炎片中黃芩有顯微鑒別，沒有黃芩主要成分的定量檢測(cè)。這給不法分子以可乘之機(jī)，以次充好，降低生產(chǎn)成本，但卻影響了藥品的療效。而且在實(shí)際的監(jiān)督中，藥品檢驗(yàn)部門按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，只能出具合格報(bào)告書，不能定其為不合格產(chǎn)品。本含量測(cè)定方法的建立，對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是有效的補(bǔ)充和提高。

[1]WS3-B-0235-90.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第二冊(cè))[S].

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典(下冊(cè))[M].第2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006:2 806.

[3]莫海濤，劉 元，宋志釗.HPLC測(cè)定雙黃消炎片中黃芩苷含量[J].中國民族民間醫(yī)藥，2009，18(17):24-25.

[4]宋吉蓮，呂鳳蓮，袁明輝.HPLC測(cè)定雙黃消炎片中黃芩苷含量[J].中國藥事，2005，19(11):47-48.

[5]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:212.