高效液相色譜法測定止痢顆粒中黃芩苷含量

郭立恒，朱山寅

(1.浙江省桐鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院，浙江 嘉興 314511; 2.浙江省嘉興市食品藥品檢驗(yàn)所，浙江 嘉興 314001)

止痢顆粒是由黃芩、葛根、黃連、木香、檳榔、地錦草等6味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒、理氣止痢功效，用于急性痢疾，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第五冊)》，原標(biāo)準(zhǔn)無含量測定項(xiàng)目[1]，也尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。黃芩主含黃芩苷，是本方的有效消炎成分之一。為有效控制止痢顆粒的質(zhì)量，筆者建立了測定該制劑中黃芩苷含量的高效液相色譜(HPLC)法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Waters 510/484/745B色譜系統(tǒng));UV-265型紫外分光光度計(jì)(日本島津)。黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號為0751-200912);止痢顆粒(市售品，批號分別為 090408，20090513，091225);甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;水為重蒸餾水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil C18分析柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.5);流速:1.0 mL/min;測定波長:278 nm;柱溫:室溫。

2.2 溶液制備

精密稱取經(jīng)60℃減壓干燥至恒重的黃芩苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含0.055 mg的溶液，作為對照品溶液。取樣品10 g，研細(xì)，精密稱取1 g，置25 mL量瓶中，加甲醇約22 mL，超聲處理30 min，放置室溫，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按處方量制備不含黃芩藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn):照上述色譜條件，吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各20μL，分別注入色譜儀。供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜圖相應(yīng)位置上有一相同的色譜峰，而陰性對照品溶液在此保留時(shí)間無干擾，見圖1。

圖1 止痢顆粒高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取黃芩苷對照品溶液(0.055 g/L)1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，按上述色譜條件，精密進(jìn)樣20μL。以黃芩苷峰面積積分值 Y為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量 X(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=7.237×106X+9.973×104，r=0.999 4(n=9)。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在0.10～0.51μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):準(zhǔn)確吸取對照品溶液20.0μL，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果黃芩苷峰面積的 RSD為1.09%(n=5)，表明儀器精密度符合要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別在制備后 0，2，4，6，8，10 h時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果黃芩苷峰面積的 RSD=1.37%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批號樣品5份，依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果的 RSD=1.44%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量樣品(批號為090408)6份，精密稱定，精密加入黃芩苷對照品適量，照2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液并按擬訂的色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

分別精密稱取不同批號的樣品粉末約1 g，依法制備供試品溶液，分別精密吸取20μL，按擬訂的色譜條件測定。3批樣品中黃芩苷的含量分別為0.453 2，0.449 3，0.450 2 mg/g(n=5)。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 討論

取對照品溶液，用紫外分光光度計(jì)在200～300 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在278 nm波長處有最大吸收，故以此作為測定波長。

曾以乙醇為溶劑進(jìn)行測定，樣品主峰分離不佳，常有列峰現(xiàn)象，對照品峰形同樣較差。以乙醇、50%甲醇、甲醇為溶劑對比考察線性關(guān)系，黃芩苷進(jìn)樣量相同的情況下，測得的峰面積乙醇最小，甲醇最大，50%甲醇略小于甲醇，r分別為0.948 4，0.980 7，0.999 4(n=6)，測得樣品中黃芩苷含量的重現(xiàn)性甲醇最好。這說明黃芩苷在乙醇中的溶解度較差，使峰面積產(chǎn)生誤差。

比較了幾種不同比例流動(dòng)相的分離效果，要使樣品中的黃芩苷與雜質(zhì)的分離達(dá)到要求，且峰形對稱而尖銳，必須增加水和磷酸的比例，同時(shí)樣品的稀釋時(shí)應(yīng)改為甲醇。擬訂的色譜條件下，黃芩苷與其他組分能達(dá)到基線分離，理論板數(shù)大于1 500。

[1]WS3-B-0904-91，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第五冊)[S].