不同產地不同規格的茯苓水溶性多糖含量比較

2012-11-06 06:04:54胡明華梁永威彭川叢

中國藥業 2012年7期

胡明華，梁永威，彭川叢

(1.無限極＜中國＞有限公司，廣東廣州 510665; 2.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510006)

茯苓為多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，為藥食兩用的傳統中藥，在我國分布于吉林、湖北、安徽、云南、四川、浙江、湖南、河南、福建、貴州、臺灣、廣西等地，生長栽培方式、加工炮制方法、儲藏條件等諸多因素會影響其化學成分的含量。茯苓中最主要的化學成分是茯苓多糖，含量可達茯苓干重的84.2%[1]，主要存在于茯苓細胞壁中，按溶解度的不同又分為水溶性茯苓多糖和堿溶性多糖。堿溶性多糖不溶于水，是一種帶有(1→6)支鏈的(1→3)鍵接的β-D-葡聚糖，經化學改造增加其水溶性后具有顯著的抗腫瘤作用[2]。含量較低的水溶性茯苓多糖具有明顯的抗腫瘤活性[3]。筆者從產地和規格兩方面對茯苓水溶性多糖含量進行研究，比較了不同產地、不同規格茯苓之間的含量差異。現報道如下。

1 儀器與試藥

UV-2800型紫外可見分光光度計(尤尼柯＜上海＞儀器有限公司);TL-5.0W型臺式離心機(上海市離心機械研究所);PL-303型電子天平(梅特勒-托利多＜上海＞有限公司)。D-無水葡萄糖、濃硫酸、95%乙醇、苯酚均為國產分析純。各產地和規格的茯苓藥材采購于當地，共5個產地3種規格。

2 方法與結果

2.1 多糖含量測定

2.1.1 葡萄糖對照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的 D-無水葡萄糖0.010 g，加水溶解，并定容至100 mL，混勻，制成葡萄糖對照品溶液，質量濃度為0.1 g/L。

2.1.2 測定條件優選

測定波長[4-9]:精密吸取葡萄糖對照品溶液1.0 mL和供試品溶液1.0 mL，分別置20 mL試管中，準確補水至2 mL，加入5%苯酚液1.0 mL，在旋轉混勻器上混勻，然后迅速加入5 mL濃硫酸，再次混勻后，置沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫，在紫外分光光度儀上測定400～520 nm波長之間的吸收度。結果葡萄糖對照品溶液、供試品溶液均在490 nm波長處有最大吸收，故以此為測定波長。

苯酚用量:精密吸取葡萄糖對照品溶液1.0 mL 5份，置20 mL的試管中，準確補水至2 mL，分別加入5%苯酚液0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，在旋轉混勻器上混勻后，各加入5 mL濃硫酸，再次混勻，置沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫，以純凈水作空白對照，在490 nm波長處測定吸光度。結果當5%苯酚加入量為1.0 mL時，樣品的吸光度最大。

濃硫酸用量:精密吸取葡萄糖對照品溶液1.0 mL 5份，置20 mL試管中，準確補水至2 mL，各加入5%苯酚液1.0 mL，在旋轉混勻器上混勻后，分別加入濃硫酸 3，4，5，6，7 mL，再次混勻后，置沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫，以純凈水作空白對照，在490 nm波長處測定吸光度。結果當濃硫酸加入量為5 mL時，樣品的吸光度最大。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察:分別精密吸取葡萄糖對照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置 20 mL 試管中，準確補水至 2 mL，分別加入5%苯酚液1.0 mL，在旋轉混勻器上混勻后，加入5 mL濃硫酸，再次混勻，置沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫，以試劑空白作對照，在490 nm波長處測定吸光度。以吸光度 A為縱坐標、葡萄糖對照品溶液加入的體積 C為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 A=0.698 7 C+0.010 3，R2=0.999 7(n=6)。結果表明，葡萄糖對照溶液加入體積在0.001～0.015 mL范圍內與吸光度線性關系良好。

重復性試驗:精密吸取供試品溶液1 mL，按含量測定項下方法操作，平行操作6份，以試劑空白作對照，測定吸光度。結果的RSD=0.92%(n=6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗:精密吸取同一供試品溶液0.5 mL，按含量測定項下方法操作，以試劑空白作對照，每隔30 min測定1次吸光度，考察樣品3 h內的穩定性。結果的 RSD=0.15%，表明供試品溶液在3 h內顯色穩定。

精密度試驗:精密吸取葡萄糖對照品溶液1 mL，按含量測定項下方法操作，以試劑空白作對照，連續測定5次吸光度。結果的RSD=0.06%，表明儀器精密度良好。

回收率試驗:精密吸取供試品溶液0.5 mL，加入葡萄糖對照品溶液0.5 mL，按含量測定項下方法操作，平行操作6份，以試劑空白作對照，測定吸光度。結果平均回收率為94.32%，RSD=0.95%，表明方法準確度良好。

2.2 提取工藝優選

2.2.1 供試品溶液制備

分別取每個產地的3種不同規格茯苓等量混合粉碎，過60目篩，稱取10 g茯苓粉，按正交表設計的條件進行提取，趁熱用濾布過濾，濾渣用少量熱水洗滌，合并濾液，用大容量的離心機離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，濃縮至 10 mL，加入 95% 乙醇50 mL，醇沉濃度為80%，放置過夜;離心(4 000 r/min，15 min)，去掉上清液，沉淀用80%乙醇洗滌兩次，每次約15 mL，離心，傾去上清液;沉淀加入2 mol/L硫酸溶液5 mL，攪拌使其溶解，轉移至200 mL燒杯中，并加入約100 mL水，加熱至沸騰，使沉淀徹底溶解，冷卻后加水定容至500 mL，用小瓶留樣，備用，得供試品溶液。

2.2.2 含量測定

分別取1 mL供試品溶液，按線性關系考察項下方法操作，測定吸光度，計算含量。

2.2.3 正交試驗與結果

本試驗選取4個主要因素，因素A為第1次煎煮時間，因素B為第1次加水量，因素C為第2次煎煮時間，因素D為第2次加水量。每個因素擬2個水平，選用 L8(27)表進行正交試驗。因素水平見表1，正試驗結果見表2，方差分析見表3。由表2和表3可知，最優的提取條件為A2B2C1D2，即第1次加水20倍，第1次煎煮2h，第2次加水15倍，第2次煎煮1h。