玉米種質資源醇溶蛋白的遺傳多樣性分析

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(1 山西省農科院材料資源研究所，太原 030031；2 山西大學生命科學與技術學院，太原 030006)

玉米種質資源醇溶蛋白的遺傳多樣性分析

崔永霞1，張海萍1，任元1，張叢卓1，田懷東2，雷柴衛2，張效梅1

(1 山西省農科院材料資源研究所，太原 030031；2 山西大學生命科學與技術學院，太原 030006)

隨著分子生物學的發展，蛋白質電泳圖譜技術已成為生物多樣性研究和材料鑒別的重要手段。本實驗對現有的150份特種玉米種質資源，利用SDS-PAGE電泳技術，獲得玉米醇溶蛋白的不同電泳譜帶(γ、α1、α2、β醇溶谷蛋白組分)，主要表現在三個方面：(1)分子量的高低不同，電泳條帶數目不同及相對表達量不同;(2)利用等電聚焦(IEF)電泳法分析了材料間分子量相近而等電點不同的蛋白質組分，共檢測到材料內和材料間13條不同的差異帶和特殊帶；(3)對其電泳譜帶進行聚類分析，將全部供試材料分為6大類，獲得了多樣的玉米醇溶谷蛋白資源，解析了玉米種質資源種子醇溶谷蛋白的表型特征，揭示了其生化性狀的多樣性。

玉米；種質資源；醇溶蛋白；電泳圖譜；聚類分析

玉米籽粒中蛋白質含量一般在10%左右，其中80%在胚乳中，而另外20%在胚中[1]。醇溶蛋白是玉米中主要的貯藏蛋白,約占所有蛋白的45%～50%[2]。玉米醇溶蛋白具有很強的韌性、疏水性、可降解性、抗菌性等特點,廣泛用于食品、醫藥、紡織、造紙等工業[5,6]。

美國、日本都在玉米醇溶蛋白的利用上加大研究、開發力度，并從玉米淀粉渣中提取了玉米醇溶蛋白[3]。我國對玉米種子蛋白質的研究主要集中在粗蛋白含量、總賴氨酸含量等不穩定的數量性狀的測定工作上，在分子水平上還沒有系統展開。為此，在種子蛋白質分子的多樣性研究中必須充分利用我國豐富的玉米種質資源，為我國走向多樣化優質蛋白玉米的育種研究提供理論指導及遺傳資源支持。

本研究立足于玉米醇溶谷蛋白解析，并對結果進行聚類分析，從分子水平上揭示我國玉米材料資源的多樣性,促進玉米營養品質的育種研究，為特種玉米材料蛋白質的遺傳育種學研究奠定基礎，以滿足玉米籽粒產業的多樣化社會需求。

1 材料與方法

1. 1 材料

所選150份玉米材料是保存在山西省農業科學院品種資源研究所種質庫內的育種高代品系或具有特殊農藝性狀的育種資源品系。其中：早熟普通玉米1～47，共47份；晚熟普通玉米113～143，145～150，共37份；黑糯玉米48～68，共21份；白糯玉米69～73，77～83，100～112，共25份；爆裂玉米74～76，84～88，94～99，144，共15份；黑甜玉米89～93，共5份。

1.2 方法

(1) 表型鑒定。將150份玉米材料進行田間種植、室內考種，鑒定其主要植物學特征、農藝特點；對于種質形態性狀(如株高、穗位高、粒形、粒色、軸色、穗行數、行粒數、穗長、百粒重等)進行重復鑒定(重復數次)，并對一些重要的農藝性狀(如生育期、抗病性、抗逆性)進行鑒定，將這兩類鑒定結果進行初步分類整理[8]。

(2) 提取醇溶蛋白。參照Tian等的方法[9]，提取醇溶谷蛋白。每份材料各取1粒種子,去胚后用研缽磨碎,然后稱取研磨后的粉末0.115 g,倒入1.5 mL離心管中,加入300 μL樣品提取液在12℃下振蕩2 h；14 000 rpm下離心15 min后，在650 μL的上清液中，加入等體積的4℃超純水，清洗醇溶谷蛋白沉淀，沉淀中加入400 μL的蛋白質溶解緩沖液，所得蛋白質溶液用于SDS-PAGE。

(3) 電泳、染色和照相。使用pH為8.3的電泳緩沖液、8℃的恒溫冷卻循環水，采用時間分段升壓法進行電泳。每個樣品上樣量為10 μL。在500 V恒壓條件下電泳6 h。電泳結束后,使用含有0.1%(w/v)考馬斯亮藍R-250、50%(v/v)甲醇、10%(v/v)乙酸的染色液進行凝膠染色12 h,用蒸餾水沖洗3～5次,使用含有25%甲醇和10%乙酸的脫色液進行凝膠背景脫色直至譜帶清晰,統計并拍照保存。

(4) 等電聚焦(IEF)電泳法測定蛋白質的等電點。用IEF樣品緩沖液提取分析樣品，洗干凈兩塊IEF專用玻璃板，進行硅化和反硅化處理，放上夾條，夾好夾子。配膠、灌膠，待膠凝好后，將塑料墊片底部擦干，放于電泳槽上。在膠面兩邊各放一根浸透電極緩沖液的電極條。在膠面上任意位置放上擦鏡紙片，在紙片上加樣，蓋蓋子，橫功率25 W電泳，待電流達4 mA以下，停止電泳。取出塑料片，放入固定液中15 min，取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至條帶出現即脫色保存。

(5)數據處理。按同一遷移率電泳條帶有的記為1,無則記為0來詳細記錄醇溶蛋白電泳譜帶。結果顯示,供試的150份材料，遷移率不同的譜帶類型13條。然后進行統計，按0∶1的方式將觀察到的實驗結果記錄到計算機上統計成Excel文件。計算材料間的遺傳相似系數(GS)。

GS=2Nij/(Ni+Nj)

式中：Ni為材料i中出現的譜帶數；Nj為材料j中出現的譜帶數；Nij為材料i和材料j中共有的譜帶數。

根據遺傳相似系數計算出遺傳距離(GD)。

GD=1-GS

參考對照材料的標準電泳圖譜,形成醇溶蛋白原始數據,用分析軟件NT-sys 2.10e進行統計和聚類分析[11，12]。

2 結果與分析

2.1 醇溶谷蛋白的SDS-PAGE結果

采用SDS-PAGE技術，根據蛋白的溶解度和分子量的不同，可將玉米醇溶谷蛋白分為三類：α，β，γ。α醇溶谷蛋白的分子量為21 000～25 000和19 000(Hasting，1984；Wilson，1985b)；β醇溶谷蛋白的分子量為17 000和18 000(Esen,1987)；γ醇溶谷蛋白的分子量為27 000(Esen,1987)。從所選擇出的15個材料的醇溶谷蛋白的SDS-PAGE圖譜，可以看出γ醇溶谷蛋白的分子量大約為27 000，α醇溶谷蛋白的分子量在21 000～27 000，β醇溶谷蛋白的分子量大約為17 000。使用凝膠成像系統與圖像分析軟件，分析150份玉米自交系種子醇溶谷蛋白的各組分的組成、分子量等生化性狀，發現在電泳凝膠上普通玉米“PC130”自交系的γ，α，β醇溶谷蛋白組分的生化性狀與相關文獻報道的結果基本一致，其表型特征在所有自交系材料中的發生頻度最高(圖1)。基于此，“PC130”被確定為對照、用于其它自交系醇溶蛋白各組分的性狀表征。

圖1 玉米種質資源醇溶谷蛋白的SDS-PAGE1. 對照(PC130)；2.運系98-3；M.分子量標準

圖2 γ醇溶谷蛋白帶型的多樣性1.對照；2.分子量偏低；3.分子量偏高；4.相對表達量高；5.相對表達量低；M.Mark

從電泳圖譜圖2可以看出，γ醇溶蛋白的差異性主要表現在分子量和相對表達量上。材料2的γ醇溶谷蛋白分子量偏低，材料3的γ醇溶谷蛋白分子量偏高；材料4的γ醇溶谷蛋白相對表達量高，材料5的γ醇溶谷蛋白相對表達量低。

從電泳圖譜圖3可以看出，β醇溶谷蛋白的差異性主要表現在分子量和相對表達量上。材料6的β醇溶谷蛋白的分子量偏高，材料7的β醇溶谷蛋白分子量偏低；材料8的β醇溶谷蛋白相對表達量少，材料9的β醇溶谷蛋白相對表達量多。

圖3 β醇溶谷蛋白帶型的多樣性1.對照；6.分子量偏低；7.分子量偏高；8.相對表達量高；9.相對表達量低；M.Mark

圖4 α1醇溶谷蛋白帶型的多樣性1.對照；10.一條帶；11.兩條帶；12.集中；13.相對表達量高；M.Mark

從圖4和圖5可以看出，α醇溶谷蛋白包括α1和α2。α1的差異性主要表現在蛋白條帶數的多少與相對表達量上，材料10的α1醇溶谷蛋白有一條帶；材料11的α1醇溶谷蛋白有兩條帶；材料12的α1醇溶谷蛋白集中，材料13的α1醇溶谷蛋白相對表達量高。α2的差異性主要表現在蛋白條帶數目上，材料14的α2醇溶谷蛋白有5條帶，材料15的α2醇溶谷蛋白有2條帶，材料16的α2醇溶谷蛋白有2條帶，材料17的α2醇溶谷蛋白有3條帶。

圖5 α2醇溶谷蛋白帶型的多樣性14. 5條帶；15.兩條帶；16.兩條帶；17. 3條帶；1.對照;M.Mark

從150份玉米材料的電泳圖譜上統計結果表明：玉米材料間醇溶谷蛋白具有豐富的遺傳多樣性，主要表現在三個方面：分子量的高低不同，電泳條帶數目的不同以及相對表達量的不同。

2.2 等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)電泳分析結果

每個材料之間分子量相近，很難區分分子量相近而等電點不同的蛋白質組分。為了詳細解釋醇溶谷蛋白的變異，分離分子量相近而等電點不同的蛋白質組分，利用等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)電泳法測定了蛋白質的等電點。等電聚焦(IEF)是一種利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術，可以分辨等電點(pI)只差0.001 pH單位的生物分子，其分辨力高，重復性好，樣品容量大，操作簡便。如圖6所示，150份供試材料中共檢測到13條具有不同遷移率的譜帶，而且13條變異帶在每個材料中以不同的組合、表達量高低和缺失存在，顯示出供試玉米材料在醇溶蛋白位點變異豐富，在等位基因水平上具有豐富的遺傳多樣性。

圖6 利用等電聚焦(IEF)電泳法篩選出的13條變異類型

2.3 150份參試玉米材料醇溶蛋白聚類分析

用非加權成對群算術平均法(UPGMA)對150份玉米材料進行聚類分析。將聚類結果與它們的農藝性狀進行比較,對實驗材料按照形狀進行分類，分為：生育期在110 d以下的為早熟普通玉米、生育期在110 d以上的為晚熟普通玉米、白色糯玉米、爆裂玉米、黑色糯玉米和黑甜玉米共6類。同時對各類玉米材料進行分別聚類分析。

2.3.1 早熟普通玉米材料醇溶蛋白聚類分析

早熟普通玉米材料47份，在遺傳相似系數為0.56全部聚為一類,遺傳相似系數為0.58時聚為三大類。第一類包括42個材料,它們又可劃分為2個亞群。第1亞群包含21個材料,第二亞群只有39號材料。第二類只有29號材料。第三類含4個材料，在遺傳相似系數為0.67時分成兩個亞群，第一亞群包含13，14號材料，第二亞群包含42，43號材料。

2.3.2 晚熟普通玉米材料醇溶蛋白聚類分析

晚熟普通玉米材料37份，在遺傳相似系數為0.48時全部聚為一類,遺傳相似系數為0.60時聚為三大類。第一類包括34個材料,它們又可劃分為2個亞群。第1亞群包含33個材料,第二亞群只有134號材料。第二類包含42，43號2個材料。第三類只有148號材料。

2.3.3 白糯玉米材料醇溶蛋白聚類分析

白糯玉米材料25份，在遺傳相似系數為0.49全部聚為一類,遺傳相似系數為0.62時聚為三大類。第一類包括29號材料。第二類包括17個材料,它們又可劃分為2個亞群。第1亞群包含14個材料；第二亞群包含3個材料，在遺傳相似系數為0.74時分成兩個亞群，第一亞群只有78號材料，第二亞群包含77，79號材料。第三類含3個材料，在遺傳相似系數為0.74時分成兩個亞群，第一亞群只有71號材料，第二亞群包含101，104號材料。

2.3.4 爆裂玉米材料醇溶蛋白聚類分析

15份爆裂玉米材料，在遺傳相似系數為0.66時全部聚為一類,遺傳相似系數為0.72時聚為三大類。第一類包括2個材料,遺傳相似系數為0.85時它們又可劃分為2個亞群。第1亞群是74號材料,第二亞群是76號材料。第二類含12個材料，在遺傳相似系數為0.75時分成兩個亞群，第一亞群包含11個材料，第二亞群只有98號材料。第三類是144號材料。

2.3.5 黑糯玉米材料醇溶蛋白聚類分析

21份黑糯玉米材料，在遺傳相似系數為0.58時全部聚為一類,遺傳相似系數為0.69時聚為三大類。第一類包括17個材料,遺傳相似系數為0.79時，它們又可劃分為2個亞群。第1亞群包含14個材料,第二亞群在遺傳相似系數為0.90時可劃分為2個亞類，第一亞類包含49，53號材料，第二亞類只有57號材料。第二類含3個材料，在遺傳相似系數為0.79時分成兩個亞群，第一亞群包含50，58號材料，第二亞群是66號材料。第三類是62號材料。

2.3.6 黑甜玉米材料醇溶蛋白聚類分析

5份黑甜玉米材料，在遺傳相似系數為0.42時全部聚為一類,遺傳相似系數為0.51時聚為兩大類。第一類是89號材料。第二類包括4個材料，遺傳相似系數為0.68時它們又可劃分為2個亞群，第1亞群包含3個材料,第二亞群只有92號材料。

3 小結與討論

(1)利用SDS-PAGE技術系統檢測了試供玉米材料的醇溶蛋白譜帶，結果表明，150份供試材料的分子量高低不同，電泳條帶數目的不同以及相對表達量的不同。

(2)利用等電聚焦(IEF)電泳法共檢測到13條具有不同遷移率的譜帶,顯示出供試玉米材料在醇溶蛋白位點變異豐富，在等位基因水平上具有豐富的遺傳多樣性。

(3)根據聚類分析可以將全部供試材料分為6大類。選擇遺傳距離較大的材料作為親本進行雜交,預期后代將獲得較大的超親分離現象。例如采用遺傳距離較遠的早熟普通玉米39號材料和13，14號材料雜交，其F1代的產量明顯高于13和14號材料雜交的產量。對玉米醇溶蛋白遺傳多樣性進行分析,也發現其具有豐富的遺傳多樣性且與材料的來源地有關。對材料進行聚類分析，是研究材料間遺傳差異和種質利用的基礎，也是雜交育種、親本選配的重要參考依據。

本試驗所選用的150份玉米材料基本上都為具有某些優異特性的資源，可以通過研究發現其中的有益基因，用于指導、輔助育種研究。研究它們之間的遺傳關系,明確玉米屬種質親緣關系的遠近，對于進一步利用玉米優異特性具有重要意義。根據聚類結果制定系統的育種計劃，可以避免推廣材料間的遺傳背景日趨單一的狀況,這也為玉米的高產育種奠定了選擇種質資源的理論基礎。因此，在甜玉米、糯玉米、爆粒玉米等特種玉米雜交育種中，大規模地調查親本材料間的遺傳背景，有目的有計劃地選擇遺傳距離較遠的雙親材料，重視開發利用玉米農家種和野生資源的優良基因，生物技術與常規育種技術有機結合，對于科學組配雜交親本,加速玉米育種進程有著廣闊的應用前景。

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S513.01

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1001-5280(2012)01--03

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.01.