Ghrelin及GHSR在急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織的表達

方春蕓 唐國都 梁志海 唐曦平

·論著·

Ghrelin及GHSR在急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織的表達

方春蕓 唐國都 梁志海 唐曦平

目的觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織ghrelin以及生長激素促分泌素受體(GHSR)的表達，探討ghrelin在ANP發(fā)病機制中的作用。方法70只大鼠按完全隨機法分為ANP組和對照組，每組35只。采用逆行膽胰管注射4%牛磺膽酸鈉的方法制備大鼠ANP模型；對照組僅開腹，輕翻動胰腺。術(shù)后3、6、12、24、48 h處死大鼠，取血測血清淀粉酶，取胰腺行常規(guī)病理檢查并評分，應用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測胰腺組織ghrelin、GHSR的mRNA及蛋白表達。結(jié)果ANP組大鼠血清淀粉酶濃度從造模后3 h開始升高，6 h達(8244±2950)U/L，顯著高于對照組(P<0.05)；胰腺病理損傷及評分隨時間延長逐漸加重，24 h評分為(11.91±1.31)分，顯著高于對照組的(3.12±1.60)分。ANP組大鼠胰腺組織ghrelin mRNA和GHSR mRNA表達隨時間的延長而逐漸升高，48 h達峰值，分別為1.29±0.64和0.94±0.16，均顯著高于對照組的0.58±0.05和0.19±0.03(P值均<0.05)。ANP組大鼠胰腺組織ghrelin和GHSR蛋白的表達在48 h時達峰值，分別為3.05±0.48和2.34±0.32，均顯著高于對照組的2.18±0.23和1.55±0.10(P值均<0.05)。結(jié)論ANP大鼠胰腺組織ghrelin、GHSR的mRNA及蛋白表達均顯著增加，且與胰腺病變嚴重程度有關(guān)。

胰腺炎，急性壞死性； 受體，內(nèi)源性物質(zhì)； 生長激素促分泌物受體； Ghrelin

Ghrelin是一種生長激素促分泌物受體(growth hormone secretagogue recepter，GHSR)的內(nèi)源性配體。研究表明[1]，ghrelin通過與GHSR作用抑制炎性因子產(chǎn)生。本研究檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織中g(shù)hrelin和GHSR mRNA及蛋白的表達，探討ghrelin 在ANP發(fā)病機制中的作用。

材料與方法

一、實驗動物及分組

SD大鼠70只，清潔級，雄性，體重250～300 g,由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。適應性喂養(yǎng)1周后按完全隨機法分為對照組和ANP模型組， 每組35只。采用膽胰管逆行注入4%牛磺膽酸鈉(日本TCI公司)1 ml/kg體重的方法制備ANP模型。對照組開腹輕翻動胰腺組織后關(guān)腹。術(shù)后3、6、 12、 24、48 h分批處死大鼠，采血并分離血清；取胰腺組織，部分10%甲醛固定，部分置-80℃保存。

二、觀測指標及檢測方法

1．血清淀粉酶檢測：由全自動生化分析儀測定。

2．胰腺組織病理學檢查及評分：固定的胰腺組織常規(guī)脫水、包埋、切片及HE染色，光鏡下閱片。參考Schmidt等[2]標準從水腫、出血、壞死及炎癥細胞浸潤4個方面進行評分。

3．胰腺組織ghrelin mRNA及GHSR mRNA檢測：采用RT-PCR法。用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取組織總 RNA。ghrelin引物上游5′-AGCCCAGCAGAGAAAGGAAT-3′，下游5′-AGGGAGCATTGAACCTGATTT-3′，擴增片段137 bp；GHSR引物上游5′-AAGCTGGTCATCCTTGTCATCT-3′，下游5′-TTCACTGTCTGCTTGTGGTTCT-3′，擴增片段305 bp；GAPDH(內(nèi)參)引物上游5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游5′-GTCCACCACCCTGTTGCT-GTAG-3′，擴增片段496 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。PCR擴增條件：95℃ 4 min，95℃ 30 s、 59℃ 30 s、72℃ 30 s，35 個循環(huán)，72℃ 7min。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后進行凝膠成像系統(tǒng)分析，以ghrelin/GAPDH和GHSR/GAPDH灰度比值表示mRNA相對表達量。

4．胰腺組織ghrelin及GHSR蛋白檢測：采用蛋白質(zhì)印跡法。稱取80 mg凍存胰腺組織標本，剪碎后研磨，用總蛋白提取試劑盒(碧云天公司)提取胰腺組織總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取50 g樣品常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測ghrelin及GHSR蛋白。兔抗鼠ghrelin多抗(美國proteintech公司)和兔抗鼠GHSR多抗(abcam公司)1∶600稀釋，山羊抗兔二抗(辣根過氧化物酶標記) 1∶2000稀釋，最后ECL發(fā)光，X膠片曝光。應用圖像分析儀掃描，獲取條帶灰度值。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶的變化

ANP組大鼠血清淀粉酶濃度于造模后3 h明顯上升，6 h達峰值，并持續(xù)處于高水平狀態(tài)，較對照組同時點大鼠顯著升高(P值均<0.05，表1)。

二、胰腺大體及病理改變

對照組大鼠胰腺大體無明顯改變；鏡下見胰腺小葉完整，細胞形態(tài)正常，無明顯出血、壞死，偶有輕度水腫及少量炎細胞浸潤。ANP組大鼠胰腺明顯水腫，有暗紅色出血樣及膠凍樣壞死改變；鏡下見胰腺間質(zhì)增寬，腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，腺泡細胞空泡樣變，炎性細胞浸潤，局灶或大片出血壞死，病理評分均較同時點對照組明顯升高(P值均<0.05，表1)。

三、胰腺組織ghrelin mRNA及GHSR mRNA表達

ANP組大鼠胰腺組織ghrelin mRNA和GHSR mRNA表達均較同時點對照組明顯升高(t值分別為4.121、11.334、6.270、15.089、20.090；6.109、17.506、8.143、10.074、6.619。P值均<0.05)，表達量隨時間延長而逐漸增加(圖1，表2)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶水平和胰腺病理評分

注：與對照組比較，aP<0.05

1～5：ANP組3、6、12、24、48 h ；6～10：對照組3、6、12、24、48 h

四、胰腺組織ghrelin及GHSR蛋白表達

ANP組胰腺組織ghrelin和GHSR蛋白表達在12、24、48 h點均較同時點對照組顯著升高(t值分別為3.003、2.646、3.706；3.702、5.402、5.288。P值均<0.05，表2，圖2)。

圖2 兩組胰腺組織ghrelin(上)、GHSR(下)表達

自從1999年Kojima等發(fā)現(xiàn)ghrelin之后，研究表明它有多種生物學功能，包括刺激生長激素釋放、調(diào)節(jié)攝食、刺激胃酸及胃蛋白酶的分泌、調(diào)節(jié)血壓和心率、調(diào)節(jié)胰島素分泌等[3]。此外，ghrelin有抑制炎癥反應的作用，可顯著降低致炎物質(zhì)誘導的炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的表達及分泌[1]。Kizaki等[4]應用siRNA技術(shù)沉默ghrelin基因后，NF-κB的活性及TNF-α基因表達明顯增加，提示ghrelin通過負向調(diào)控NF-κB的活化來抑制前炎癥因子的產(chǎn)生。在急性胰腺炎(AP)研究方面，Kerem等[5]的研究顯示，ANP大鼠血清ghrelin水平在造模后24 h明顯升高，并于48 h達到高峰，可以作為AP疾病嚴重程度的觀察指標。Warzecha等[6]、Sehirli等[7]采用外源性ghrelin干預ANP大鼠，發(fā)現(xiàn)可減輕胰腺及遠隔器官的損傷，其機制包括改善臟器的血流灌注、抑制炎癥因子產(chǎn)生、促進胰腺細胞增殖等。Zhou等[8]報道，ghrelin可阻斷炎癥信號通路，抑制核因子NF-κB的表達，減輕ANP并發(fā)的肝損傷。Zhang等[9]、Dembinski等[10]報道，ghrelin主要通過影響胰腺外分泌、抗氧化及抑制細胞因子介導的炎癥反應而減輕胰腺的損傷。

表2 各組大鼠胰腺ghrelin mRNA及蛋白、GHSR mRNA及蛋白的表達變化

注：與對照組比較，aP<0.05

Ghrelin需要與其功能性受體GHSR-1α結(jié)合才能發(fā)揮其功能。Delgado等[11]研究表明，ghrelin能抑制自身免疫所產(chǎn)生的T細胞，當細胞被炎性反應激活后，細胞內(nèi)GHSR出現(xiàn)明顯的激活極化現(xiàn)象，并且mRNA表達也明顯升高，其機制可能是當炎癥發(fā)生時，炎性反應所分泌的致炎因子能促進保護性的物質(zhì)ghrelin的表達和分泌，同時上調(diào)其受體GHSR的表達，而ghrelin反過來通過激活受體來抑制這些致炎因子，減輕感染、中毒性休克引起的全身炎癥反應綜合征(SIRS)。另外，也可能是ghrelin通過抑制氧自由基的產(chǎn)生，激活位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的ghrelin受體來增加生長激素的釋放，提高組織的再生和維持完整性的功能，從而增強胰腺組織損傷時的自然防御能力[12]。

本實驗結(jié)果顯示，ANP大鼠胰腺組織ghrelin mRNA和GHSR mRNA表達水平隨時間的延長而逐漸增加，且高于對照組，但ghrelin和GHSR蛋白表達在3、6 h點上與對照組差異無統(tǒng)計學意義，這可能是AP早期未充分應答的原因。隨著巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞過度激活，產(chǎn)生瀑布式級聯(lián)反應，不斷產(chǎn)生的炎性因子促進ghrelin及其受體的表達，并隨疾病發(fā)展呈上升趨勢，提示ghrelin及受體在AP時的表達可能與病變嚴重程度有關(guān)。Ghrelin作為一個重要的改善炎癥的藥物，在AP治療上具有潛在的臨床價值和重要的應用前景。

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Expressionofghrelinandhormonesecretagoguereceptorinpancreasofratswithacutenecrotizingpancreatitis

FANGChun-yun,TANGGuo-du,LIANGZhi-hai,TANGXi-ping.

DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospital,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

TANGGuo-du,Email:tguodu02@yahoo.com.cn

ObjectiveTo observe the expression of ghrelin and growth hormone secretagogue receptor (GHSR) in pancreas of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP), and investigate the role of ghrelin in the pathogenesis of ANP.MethodsSeventy SD rats were randomly divided into ANP group (n=35) and control group (n=35). ANP model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct. Rats in the control group underwent laparotomy with gentle pancreas manipulation only. At 3, 6, 12, 24, 48 h after ANP induction, the rats were sacrificed, and the serum level of amylase was determined, pathological changes in pancreatic tissue were routinely observed and scored. The expressions of ghrelin mRNA, protein and GHSR mRNA, protein in pancreas were evaluated by RT-PCR and Western blot.ResultsSerum amylase level began to increase at 3h after sodium taurocholate injection and reached the peak value at 6 h [(8244±2950)U/L], which was significantly higher than that in control group (P<0.05). Pancreatic injuries was aggravated with time, the pathologic score at 24 h was (11.91±1.31) score, which was significantly higher than (3.12±1.60) score in the control group. The expressions of ghrelin mRNA and GHSR mRNA in pancreas of ANP group were increased gradually with time, and were significantly higher than those of control group at all time points, at 48 h, 1.29±0.64vs0.58±0.05 and 0.94±0.16vs0.19±0.03,P<0.05. The expressions of ghrelin protein and GHSR protein in pancreas of ANP group were significantly higher than that in control group at 12, 24, 48 h. at 48 h, 3.05±0.48vs2.18±0.23 and 2.34±0.32vs1.55±0.10(P<0.05).ConclusionsThe expressions of ghrelin mRNA, protein and GHSR mRNA, protein of pancreas are significantly increased in rats of ANP, and are associated with the severity of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Receptors, endogenous substances; Growth hormone secretagogue recepter; Ghrelin

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.06.007

國家自然科學基金(81060043)

530021 廣西南寧，廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院

唐國都，Email:tguodu02@yahoo.com.cn

2012-07-04)

(本文編輯：屠振興)