伊馬替尼對慢性粒細胞白血病患者T細胞的影響研究

劉曉蕾，梁嘉妮，梁珊妮，劉永建，姚海英，蔡 怡

（1.保定市第一中心醫(yī)院 血 液內(nèi)科，河北 保 定071000；2.保定市第二醫(yī)院，河北 保 定071000；3.河北大學附屬醫(yī)院，河北 保 定071000）

甲磺酸伊馬替尼是臨床上治療慢性粒細胞白血病（CML）的一線抗癌藥，通過競爭性抑制酪氨酸激酶而有效地治療CML。而免疫細胞激活和分化需要ABL酪氨酸激酶的激活，伊馬替尼可能通過阻斷該信號途徑抑制免疫功能。本研究通過體外實驗探討伊馬替尼對慢性粒細胞白血病患者T淋巴細胞增殖和活性的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

30例慢性粒細胞白血病患者外周血細胞的PMI－1640培養(yǎng)液購自上海麗臣生物科技有限公司，10%胎牛血清購自Sigma公司，尼龍毛柱購自日本W(wǎng)AKO，植物血凝素（PHA）購自上海生工，二甲基亞砜（DMSO）購自 millipore，伊馬替尼（Imatinib）購自Selleck公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自sigma公司，抗人CD 3單克隆抗體、FITC標記的CD 69、CD 25和藻紅蛋白（PE）標記的HLA－DR單克隆抗體購自Epigenbiotech。

1.2 方法

1.2.1 T細胞采集與處理 從2006－2011年在我院治療的在治和隨訪的慢性粒細胞白血病患者中選出年齡45～50歲病情相似的慢性粒細胞白血病患者30例，取外周血細胞50 ml，用尼龍毛柱法分離T淋巴細胞。PBS洗滌后，用RPMI－1640完全培養(yǎng)液在96孔板上培養(yǎng)，并調(diào)整濃度為3X 106／ml，隨機分為對照組和處理組。兩組樣本同時加入PHA（5 μg／ml）、抗CD 3單克隆抗體（60 ng／ml）。處理組加入用DMSO溶解的濃度為5μmol／L的伊馬替尼，對照組中加入等量的DMSO。在37C、5%CO2和濕潤的條件下培養(yǎng)。每隔1天換液半量，并補充等濃度的PHA、抗CD3單克隆抗體和伊馬替尼。

1.2.2 MTT法檢測T細胞增殖和活性 MTT法能夠通過OD值反映細胞的存活和生長，OD值與細胞數(shù)量成正比。在加入伊馬替尼之前和加入之后24 h、48 h和72 h后分別加 MTT（5 mg／ml）檢測T細胞增殖和活性。用酶標儀在450 nm處測各孔OD值。所有標準孔及樣品均作復(fù)孔。

1.2.3 ELISA法檢測T細胞分泌的細胞因子IFN－γ 72 h后，取上述上清液，采用ELISA方法檢測IFN－γ的濃度。所有標準孔及樣品均作復(fù)孔。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測T細胞表面活性標記 用流式細胞儀標記液PBA（PBS＋10%BSA＋0.02%疊氮鈉）懸浮T細胞，分別加入CD 25、CD 69和HLADR單克隆抗體標記，通過流式細胞儀檢測細胞表面活性標記。

1.3 統(tǒng)計處理

所有實驗數(shù)據(jù)用（x－±s）表示 ，用SPSS l3.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行t檢驗。P＜0.05為顯著性檢驗標準。

2 結(jié)果

2.1 T細胞增殖和活性

與對照組相比，Imatinib加入前處理組OD值沒有顯著性差異（P＞0.05），Imatinib加入24 h、48 h和72 h后差異有顯著性（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 伊馬替尼對T淋巴細胞增殖活性的影響（OD值）（x－±s）

2.2 T細胞分泌的IFN－γ

72 h后，經(jīng)過ELISA測得對照組和處理組IFN－γ的濃度分別為（6.39±0.96）和（2.83±0.46）ng／m，兩者有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 伊馬替尼對T淋巴細胞增殖活性的影響

2.3 T細胞表面活性標記

通過流式細胞儀檢測，處理組和對照組的CD25、CD69和HLA－DR表面免疫活性標記均有顯著性差異（P＜0.05）。見表2和圖2。

表2 伊馬替尼對T淋巴細胞表面免疫活性標記表達的影響（%）（x－±s）

圖2 伊馬替尼對T淋巴細胞表面免疫活性標記表達的影響

3 討論

慢性粒細胞白血病（CML）是骨髓增殖性疾病之一，其致病基因因素是9號和22號染色體的轉(zhuǎn)位t（9；22）（q34；q11），因而導(dǎo)致BCR—ABL融合酪氨酸激酶失去抑制，過度表達激酶。［1］伊馬替尼是人工合成的的強有力的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），通過選擇性結(jié)合bcr／abl蛋白的ATP結(jié)合位點競爭性抑制abl的酪氨酸激酶使活性降低，從而阻斷下游多條信號傳導(dǎo)通路，慢性粒細胞白血病得到有效的治療。［2］業(yè)已證實，伊馬替尼不僅對CML有效，對其他由于酪氨酸激酶持續(xù)激活而引起的惡性腫瘤也有效：Ph＋ 急性淋巴細胞白血病、血小板源性生長因子受體（PDGFR）突變引起的骨髓增殖性疾病、干細胞生長因子受體c－KIT突變引起的胃腸間質(zhì)腫（GIST）［3－5］。伊馬替尼是屬于靶向分子的治療方法，是治療CML的一線抗癌藥物，它相比一般的化療藥物對癌細胞更有選擇性。［6］然而臨床上通過伊馬替尼治療CML患者過程中以及隨訪中，已發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤和感染發(fā)生率增高的情況。例如，Mattiuzzi GN等［7］發(fā)現(xiàn)給予伊馬替尼治療CML的病人發(fā)生帶狀皰疹的幾率增加，用抗病毒的藥物癥狀消失。Bekkenk MW等［8］報道一位病人用了伊馬替尼后發(fā)生EB病毒感染的B細胞淋巴瘤。Miyachi K等［9］發(fā)現(xiàn)風濕關(guān)節(jié)病病人并發(fā)2個月的CML之后用伊馬替尼治療后關(guān)節(jié)炎得到緩解。Tybulewicz VL［10］等使用了 ABL－／－敲基因的小鼠，其作用機制與伊馬替尼相同，發(fā)現(xiàn)小鼠胸腺和脾臟萎縮，出現(xiàn)T細胞和B細胞造成的淋巴細胞減少癥。這些報道或直接或間接說明伊馬替尼有抑制免疫功能的副作用。因此深入研究其副作用并進一步指導(dǎo)臨床用藥越來越必要。

本研究通過細胞培養(yǎng)、MTT法檢測T細胞增殖和活性、ELISA法檢測T細胞分泌的細胞因子、流式細胞術(shù)檢測T細胞表面活性標記等方法和過程來探討伊馬替尼對慢性粒細胞白血病患者T細胞影響。

T細胞增殖和活性實驗中，無論伊馬替尼加入前處理組OD值與對照組沒有顯著性差異，說明伊馬替尼加入前處理組和對照組的條件是一致的。而伊馬替尼加入后的24h、48h、72h處理組與對照組有顯著性差異，說明伊馬替尼能夠抑制T細胞的增殖。Allan B.Dietz［11］等通過體外培養(yǎng)健康捐獻者的T細胞，發(fā)現(xiàn)使用CML患者相似治療濃度的伊馬替尼能抑制T細胞的增殖，用植物血凝素非特異性刺激之后表現(xiàn)更明顯，而且伊馬替尼并不殺死T細胞和誘導(dǎo)T細胞凋亡。Cwynarski［12］等發(fā)現(xiàn)人T細胞和伊馬替尼在體外進行共培養(yǎng)時，T細胞的增殖能力隨著伊馬替尼濃度的增大而逐漸下降，即使用抗CD3單抗和植物血凝素刺激實驗組T細胞，其增殖能力也并沒有反轉(zhuǎn)。并且兩種刺激所產(chǎn)生的抑制程度之間沒有差異。利用流式細胞技術(shù)中的標記物annexin—V來檢測細胞凋亡情況，沒有T細胞的凋亡增加的現(xiàn)象。提示伊馬替尼的抑制作用和T細胞凋亡無關(guān)。以上兩者結(jié)果與本研究基本一致。通過ELISA法檢測T細胞分泌的細胞因子IFN－γ，處理組和對照組IFN－γ分泌量有顯著性差異，說明伊馬替尼能抑制T細胞活化為效應(yīng)T細胞，因而抑制了T細胞細胞因子的分泌。T細胞表面活性標記的檢測中，處理組和對照組的CD25、CD69、HLADR表面免疫活性標記均有顯著性差異。，進一步說明伊馬替尼抑制T細胞激活為效應(yīng)T細胞。

本實驗研究結(jié)果說明伊馬替尼能夠抑制T細胞的增殖和活化，使得效應(yīng)T細胞減少，免疫功能受到抑制，因而發(fā)生感染和癌癥的幾率增大。K Cwynarski［13］的研究結(jié)果與本研究基本一致，伊馬替尼在體外實驗中抑制了T細胞的增殖和活化。這對臨床上用藥具有指導(dǎo)意義，在伊馬替尼治療CML的同時還應(yīng)該輔以增強免疫的藥物。

［1］周 鷺，劉 紅.達沙替尼治療耐伊馬替尼慢性粒細胞白血病2例報告［J］.交通醫(yī)學，2009，23（1）：60.

［2］許 娜，杜慶鋒，楊 軍，等.酪氨酸激酶抑制劑對淋巴細胞生物學特性影響的研究［J］.國際免疫學雜志，2010，33（2）：152.

［3］Demetri GD，von Mehren M，Blanke CD，et al.Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors［J］.N Engl J Med，2002（347）：472.

［4］Magnusson MK，Meade KE，Nakamura R，et al..Activity of STI571 in chronic myelomonocytic leukemia with a platelet－derived growth factor beta receptor fusion oncogene［J］.Blood，2002（100）：1088.

［5］Cools J，De Angelo DJ，Gotlib J，et al.A tyrosine kinase created by fusion of the PDGFRA and FIP1L1 genes as a therapeutic target of imatinib in idiopathic hypereosinophilic syndrome［J］.N Engl J Med，2003，348：1201.

［6］Christiane I－U Chen，Holden T，Maecker，et al.Lee.Development and dynamics of robust T－cell responses to CML under imatinib treatment［J］.2008 111（11）：5342.

［7］Mattiuzzi GN，Cortes JE，Talpaz M，et al.Development of varicella－zoster virus infection in patients with chronic myelogenous leukemia treated with imatinib mesylate［J］.Clin Cancer Res，2003，9：976.

［8］Bekkenk MW，Vermeer MW，Meijer CJLM，et al.EBV－positive cutaneous B－cell lymphoproliferative disease after imatinib mesylate［J］.Blood，2003（102）：4243.

［9］Miyachi K，Ihara A，Hankins RW，Murai R，Maehiro S，Miyashita H.Efficacy of imatinib mesylate（STI571）treatment for a patient with rheumatoid arthritis developing chronic myelogenous leukemia［J］.Clin Rheumatol，2003（22）：329.

［10］Tybulewicz VL，Crawford CE，Jackson PK，et al.Neonatal lethality and lymphopenia in mice with a homozygous disruption of the c－abl proto－oncogene［J］.Cell，1991（65）：1153.

［11］Allan B Dietz，Lina Souan，Gaylord J.Knutson，et al.Imatinib mesylate inhibits T－cell proliferation in vitro and delayed－type hypersensitivity in vivo［J］.Blood，2004，104（4）：1094.

［12］Cwynarski K，Laylor R，Macehiarulo E，et al.Imatinib inhibits.the activation and proliferation of normal T lymphocytes in vitro［J］.Leukemia，2004，18（8）：1332.

［13］K Cwynarski，R Laylor，E Macchiarulo，et al.Imatinib inhibits the activation and proliferation of normal T lymphocytes in vitro［J］.Leukemia，2004（18）：1332.