應(yīng)用MTT檢測乙酰唑胺對卵巢癌細胞的抑制作用

王艷麗，張小猛

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦 產(chǎn)科，吉林 長 春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼 科，吉林 長 春130041）

卵巢癌患者大多伴有大量腹水，目前其病理機制尚不完全清楚。水通道蛋白1（AQP1）是Agre最早發(fā)現(xiàn)的水通道，它分布廣泛，具有特異轉(zhuǎn)運水的功能，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，目前已成為眾多學(xué)者研究的熱點［1］。AQP－1與卵巢腫瘤的關(guān)系國內(nèi)外至今尚無報道。

1 資料與方法

1.1 試劑與方法

IMDM培養(yǎng)液，Hanks液，PBS、青霉素鈉、硫酸鏈霉素、胎牛血清、均購自Sigma公司；AQP1原位雜交試劑盒、凋亡原位末端標記檢測試劑盒，購自博士德生物技術(shù)公司。MTT購自鼎國生物試劑有限公司。人卵巢癌細胞株由大連醫(yī)科大學(xué)饋贈。乙酰唑胺購自Sigma公司方法：將卵巢癌細胞體外培養(yǎng)，用96孔塑料板，每孔接種細胞懸液50μl；實驗組加入乙酰唑胺50 μl使藥物終濃度分別為1×10－8mol／L、5×10－8mol／L、10×10－8mol／L（各三孔）；對照孔不加藥（三孔）；調(diào)零孔均加培養(yǎng)液（三孔）。以下按常規(guī)MTT法進行。

1.2 統(tǒng)計學(xué)分析 各組率的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果

用MR700型酶標定量儀在試驗波長570 nm，參考波長為450 nm下測定光密度值，按下列公式計算細胞存活率：細胞存活率＝實驗組OD值／對照組OD值×100%，結(jié)果見表1，圖1。

表1 細胞存活率

圖1 細胞存活率

三條曲線分別代表不同培養(yǎng)濃度的實驗組，隨著培養(yǎng)時間增長，各實驗組細胞存活率均下降，1×10－8mol／L時細胞存活率總體趨勢雖下降，但48 h時稍稍上升，考慮人為操作誤差。5×10－8mol／L和10×10－8mol／L細胞存活率明顯下降，10×10－8mol／L在48 h和72 h數(shù)值基本相同，考慮細胞存活率沒有明顯變化。

3 討論

1988年Agre等在鑒別人類Rh血型抗原時偶然在紅細胞膜上發(fā)現(xiàn)了1種新的跨膜蛋白［1］。1991－1992年Agre等又完成了該蛋白的分子克隆和功能鑒定，證明該蛋白具有水通道功能，從而確認了細胞膜上存在轉(zhuǎn)運水的水通道蛋白的理論［2］。這種新的跨膜蛋白分子量為2.8×103，于1997年被正式命名為水通道蛋白1（AQP1）.隨后，在許多動、植物及微生物中相繼發(fā)現(xiàn)水通道蛋白。目前哺乳動物的組織中已經(jīng)鑒定11種水通道白（AQP0－AQP10），廣泛分布于各種組織和器官，在維持機體的水平衡中起著重要的作用，且與水平衡紊亂所造成的一些疾病密切相關(guān)，其中以AQP1分布最廣，作用最多。

AQP1廣泛分布于機體，特別是那些與液體吸收和分泌有關(guān)的上皮細胞及可能協(xié)同水跨膜轉(zhuǎn)運的內(nèi)皮細胞中，AQP1只允許水自由雙向的穿過細胞膜，不轉(zhuǎn)運離子，質(zhì)子等［3］。研究發(fā)現(xiàn)：多種腫瘤組織亦表達AQP1，可能與腫瘤細胞的起源，生長、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［4，5］。此外，在微血管內(nèi)皮細胞也發(fā)現(xiàn)AQP1的高度表達，推測AQP1的高表達也可能與腫瘤的血管新生有關(guān)［6－8］。

四唑鹽是一種能接受氫離子的染料，化學(xué)名是3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑藍，簡稱為MTT。MTT法測定細胞存活率的機制是MTT在活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下還原成難溶性藍色的甲潛（formazan），而死亡細胞卻不能，細胞存活越多，藍色產(chǎn)物在酶標儀上檢測的OD值就越大。本研究應(yīng)用MTT法通過檢測細胞存活率來間接檢測細胞凋亡率，可以從另一個角度來檢測乙酰唑胺對AQP1的抑制作用。結(jié)果顯示：1×10－8mol／L組分別和5×10－8mol／L組、10×10－5mol／L組相比，差異均有顯著性（P＜0.05）。5×10－8mol／L組和10×10－5mol／L組之間差異沒有顯著性（P＞0.05）。在24 h與72 h之間比較，差異有顯著性（P＜0.05）。24 h與48 h之間，48 h與72 h之間差異沒有顯著性（P＞0.05）。證明乙酰唑胺對體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞AQP1的抑制作用與時間、濃度有一定的關(guān)系但是具體的相關(guān)性還需進一步證明。實驗組在藥物濃度為1×10－8mol／L時，細胞存活率總體趨勢是下降，但是48 h時有一個上升，考慮實驗中有很多因素包括人為因素引起的誤差，考慮該點的上升為實驗的偶然性。實驗組藥物濃度為10×10－8mol／L時，隨著培養(yǎng)時間增加，24 h與48 h之間細胞存活率有明顯變化，但是48 h與72 h之間細胞存活率沒有明顯變化。實驗組在藥物濃度為5×10－8mol／L時，隨培養(yǎng)時間的增加，細胞存活率明顯下降，即細胞凋亡率明顯上升，所以原位末端標記法和逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)方法均采用該濃度為實驗組。

本實驗證明了應(yīng)用乙酰唑胺可以抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞的培養(yǎng)，推測應(yīng)用AQP抑制劑可以抑制腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，至少可能部分抑制腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，希望通過開發(fā)應(yīng)用水通道蛋白抑制劑來治療腫瘤。

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