食管癌組織中Dlk－1蛋白的表達及其意義

胡欽勇，黃衛彬

（武漢大學人民醫院 腫瘤中心，湖北 武漢430060）

作為全球十大惡性腫瘤之一的食管癌，其發病率高、危害大，世界范圍內發病率不斷上升［1］。長期以來，食管癌在中國的發病率和死亡率始終保持在很高的水平。迄今，食管癌的病因未明。DLK1（delta－like 1 homologue）亦稱 ZOG、FA1或 Pref－1等蛋白，發現于神經母細胞瘤［1］，為重要的調節細胞分化的基因［2－3］。研究證實 Dlk－1蛋白在包括急性白血病、小細胞肺癌、成神經細胞瘤及神經膠質瘤等諸多腫瘤中呈現高表達［4］。腫瘤演進過程中Dlk－1可能起到重要作用。Dlk－1在食管癌發生發展過程中的作用的相關研究尚少。我們采用SP免疫組化法檢測食管癌組織及癌旁正常組織中Dlk－1蛋白表達的情況，并探討食管癌臨床病理特征與Dlk－1蛋白表達的相關性，為臨床防治食管癌和預后判斷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

采集2008年7月至2010年7月間在我院行食管癌根治術治療患者的食管癌標本，共計41例，其中女性8例，男性33例，年齡在35－71（平均63）歲，所有患者術前未施行放、化療，病例以組織學病理檢測明確診斷。臨床食管癌TNM分期情況：Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期分別為6例、18例與29例。食管癌原發病灶組織學分級統計：低分化10例，中分化13例，高分化18例。區域淋巴結轉移狀態：陽性8例，陰性33例。其中選擇病理組織學檢查正常的20例癌旁食管組織為對照組。

1.2 方法與操作步驟

石蠟切片采用檸檬酸抗漂修復緩沖液高溫抗原修復法，采用SP免疫組織化學法染色，嚴格依照試劑盒所附步驟進行檢測，同時用已知陽性片比照.采取PBS液代替一抗作空白對照，并與正常癌旁組織進行對照。

1.3 結果判定

Dlk－1蛋白陽性定位在細胞膜或細胞質，呈現顯著棕黃染色為陽性。每張標本切片隨機選取出5個高倍視野（400倍），計算各視野中陽性細胞數的百分比數作為該視野的陽性細胞百分比，進而算出平均陽性細胞百分比作為該切片的陽性細胞百分比。染色評判標準：據陽性細胞百分比將染色結果判別成3級別：陰性（－）設定為陽性細胞百分比小于10%，陽性（＋）設定為百分比位于10%和50%之間者，而大于50%者為強陽性（＋＋），其中，陽性及強陽性標本歸入陽性組，兩組間進行統計學處理。

1.4 統計學處理

采用SPSS 12.0軟件進行統計學分析，用χ2檢驗分析組間計數資料，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果

Dlk－1蛋白陽性表達在食管組織切片標本中定位于細胞膜或細胞質內，呈現棕褐色著色，大小不等的顆粒狀，陽性細胞呈局灶性或彌漫性分布，細胞核無明顯著色。

2.2 Dlk－1蛋白表達在癌旁正常組織和食管癌組織中的情況

在41例食管癌組織中，Dlk－1蛋白陽性表達者24例（58.53%），20例癌旁正常組織中 Dlk－1蛋白表達為陰性。經列聯表χ2檢驗：Dlk－1蛋白在食管癌組織與癌旁正常組織中的表達具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 Dlk－1蛋白表達與食管癌病理分級及臨床分期之間的關系

在不同組織學級別食管癌組織中，Dlk－1蛋白表達較癌旁正常組織明顯升高，低分化、中分化及高分化各組中Dlk－1蛋白陽性表達率分別為80.00%、69.23%、38.88%，隨著分化程度的上升，Dlk－1蛋白陽性表達率顯著下降；對不同臨床TNM分期的食管癌組織的檢測結果提示，Dlk－1蛋白在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期食管癌組織中的陽性表達率分別為37.50%、59.09%、72.72%，臨床分期越晚，Dlk－1蛋白陽性表達率越高。見表1。

表1 食管癌Dlk－1蛋白表達與腫瘤分化、分期之間的關系

3 討論

定位于人染色體14q32的DLK1基因，分為細胞內多肽、細胞外區和中間跨膜區三部分，六個EGF樣重復片段存在于胞外區域，Dlk－1為一種分泌性跨膜蛋白，是表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）家族成員之一。EGF蛋白族在調節細胞分化等過程中發揮著重要作用。

近年DLK1基因在細胞分化調節等領域的功能為人們關注。其在如神經內分泌細胞分化、脂肪形成、創傷修復、血細胞生成及神經系統的分化等過程中扮演重要角色。Dlk－1可使胚胎細胞保持未分化狀態，其對胰腺細胞、骨骼細胞及肝細胞等的分化起著重要作用［5－6］。研究發現在臍帶血干細胞維持不分化狀態中Dlk－1至關重要。Dlk－1基因敲除小鼠發生肥胖癥、生長遲緩及骨骼畸形等，Dlk－1可抑制中胚層分化。Dlk－1在成年細胞中表達較胚胎組織下降，但仍對機體胰腺、血細胞、脂肪及腎上腺生長等起著重要作用。研究表明，Dlk－1在妊娠中期胎兒高表達，與此同時血細胞形成達峰，生成血細胞可被 Dlk－1促進［7，8］。肝基底細胞中 Dlk－1蛋白高表達，促進血細胞產生、肝細胞增殖與分化［9］。Dlk－1高表達通過阻斷前脂肪細胞進一步分化成脂肪細胞從而導致脂肪生成減少［10］。有研究者在不同大腸癌細胞系均檢測到Dlk－1高表達，并通過對小鼠大腸癌模型的研究，觀察到Dlk－1表達也明顯異常升高，同樣，Dlk－1蛋白高表達亦見于多種腫瘤組織。本組檢測結果顯示食管癌組織中Dlk－1蛋白表達顯著高于其在癌旁正常組織，并和腫瘤分期、級別相關。Dlk－1與食管癌的發生發展可能相關，Dlk－1可能抑制食管癌細胞分化并促使其生長。迄今，人們對Dlk－1介導的信號轉導通路知之甚少，其抑制細胞分化的作用可能以類旁分泌等機制得以發揮。

Dlk－1在食管癌的演進過程中可能起到重要作用，且其表達狀態與食管癌的預后密切相關，對其深入研究將有助于臨床診治與預后分析。本組對Dlk－1在食管癌中的表達與臨床特征之間的關系進行了初步觀察，其在食管癌中的具體作用尚需研究。

［1］Laborda J，Sausville EA，Hoffman T，et al.DLk，a putativemammalian homeotic gene differentially expressed in small cell lung carcinoma and neuroendocrine tumor cell line［J］.J Biol Chem，1993，268（6）：3817.

［2］Ditte CA，Stine JP，Louise HJ，et al.Characterization of dlk1＋cells emerging during skeletalmuscle remodeling in response tomyositis，myopathies and acute injury［J］.Stem Cells Express，2009，8（1）：12.

［3］Samulin J，Berg PR，Sundvold H，et al.Expression of DLK1 splice variantsduring porcine adipocyte development in vitro and in vivo［J］.Animal Genetics，2008，40（7）：239.

［4］Yanai H，Nakamura K，Hijioka S，et al.Dlk－1，a cell surface antigen on foetal hepatic stem／progenitor cells，is expressed in hepatocellular，colon，pancreas and breast carcinomas at a high frequency［J］.Journal of biochemistry，2010，148（1）：85.

［5］Larsen JB，Jensen CH，Schroder HD，et al.Fetal antigen 1 and growth hormone in pituitary somatotroph cells［J］.Lancet，1996，347（8995）：191.

［6］Floridon C，Jensen CH，Thorsen P，et al.Does fetal antigen 1（FA1）identify cells with regenerative，endocrine and neuroendocrine potentials？A study of FA1 in embryonic，fetal，and placental tissue and in maternal circulation［J］.Differentiation research in biological diversity，2000，66（1）：49.

［7］Tanimizu N，Nishikawa M，Saito H，et al.Isolation of hepato－blasts based on the expression of Dlk／Pref－1［J］.Journal of Cell Science，2003，116（Pt 9）：1775.

［8］White JD，Vuocolo T，McDonagh M，et al.Analysis of the callipyge phenotype through skeletal muscle development；association of Dlk1 with muscle precursor cells［J］.Differentiation research in biological diversity，2008，76（3）：283.

［9］Moore KA，Pytowski B，Witte L，et al.Hematopoietic activity of a stromal cell transmembrane protein containing epidermal growth factor－like repeat motifs［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94（8）：4011.

［10］Smas CM，Chen L，Sul HS.Cleavage of membrane－associated pref－1 generates a soluble inhibitor of adipocyte differentiation［］.Molecular and cellular biology，1997，17（2）：977.