微量胃黏膜IL－1βmRNA水平Real－time PCR檢測方法的建立

李 娟，嘉紅云，王忠英，周 強，王方金，何蘊韶，吳曉蔓

（1.廣州醫學院第二附屬醫院 檢 驗科，廣東 廣 州510260；2.中山大學達安基因診斷中心，廣東 廣 州510080）

IL－1β是胃腸道疾病發生發展的重要影響因素，可能在慢性胃炎－胃粘膜萎縮－不典型增生－胃癌這一發病模式中起了先導作用［1］。胃粘膜IL－1β的高水平表達可引起炎癥程度的增加及胃酸分泌的減少，不加干預則有可能發展成萎縮性胃炎甚至胃癌；IL－1β低表達則與胃酸分泌過多相關，有可能引發十二指腸潰瘍［2－3］。明確兒童時期胃粘膜IL－1β的表達量有利于進一步研究IL－1β在疾病發展過程及預后、轉歸中的作用。本研究將建立微量胃粘膜IL－1βmRNA 表達水平的 Real－time PCR 檢測法，為IL－1β在胃腸道疾病發生發展過程中作用的研究提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料 20例隨機選取的有消化道癥狀患兒（≤14歲）的胃粘膜標本用來做本次研究。胃粘膜標本由達安基因診斷中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 RNA核酸提取試劑盒（德國qiagen公司），Taq酶、Buffer，MgCl250 mmol／L（MBI Fermentas公司），p MD－18T 載體試劑盒（大連寶生物工程公司）。7500熒光定量PCR擴增儀（美國ABI公司）。

1.3 引物探針設計 在生物數據庫GENEBANK中找到目的基因IL－1β及內參基因GAPDH的mRNA序列，運用生物軟件Primer 5，Primer Expreess輔助設計引物探針，為避免基因組DNA序列的干擾，探針所在的位置均跨內含子，引物探針序列見表1。

1.4 cDNA的生成 用提取的總RNA做模板，使用隨機引物經逆轉錄（Reverse transcript，RT）生成cDNA，逆轉錄反應體系見表2。

表1 引物探針序列

表2 逆轉錄反應體系組成

反應條件：37℃60 min，95℃5 min滅活逆轉錄酶。最后將c DNA置－20℃保存備用。

1.5 IL－1β、GAPDH real－time反應體系及條件 見表3。

表3 Real－time PCR 反應體系

反應條件：95℃3分鐘預變性，然后95℃45秒，55℃1分鐘，擴增10個循環，再95℃30秒，55℃45秒，擴增30個循環。反應在Applied Biosystems 7500上進行，由PCR儀7500附帶的軟件ddCT study自動分析IL－1β表達水平。

2 方法驗證

2.1 引物特異性確證 IL－1β、GAPDH基因相應的PCR產物用p MD－18T載體試劑盒做克隆，菌液送交上海英駿生物技術公司測序，測序結果經BLAST比對確認了所設計引物的特異性擴增能力。

2.2 IL－1β、GAPDH反應體系擴增效率的檢測 將克隆所得菌液按10倍濃度稀釋，得到5個濃度梯度的IL－1β及GAPDH菌液（109～105拷貝／ul）。以稀釋后的菌液為模板進行real－time PCR反應，取△CT值做回歸分析：

回歸曲線的斜率為0.0023，表明本實驗所用IL－1β、GAPDH PCR反應體系的擴增效率一致，可以用GAPDH做內參來檢測IL－1βmRNA的表達水平。可見不同模板濃度的對數值與CT值間有非常好的線性關系，標準曲線的回歸系數均大于0.99（圖略）。

2.3 胃粘膜標本IL－1β、GAPDH mRNA 的檢測每份樣本cDNA 的IL－1β、GAPDH real－time PCR擴增均做三個平行復孔，GAPDH及IL－1β的復孔檢測均有較好的重現性。所有接受檢查的20例兒童胃粘膜標本經分析都得到了IL－1βm RNA的相對表達值，見表4。

3 討論

IL－1β是抑制胃酸分泌的強有力的前炎癥因子［4］，IL－1βmRNA 高表達，胃酸分泌減少，利于細菌定植，IL－1βm RNA表達增高可能是胃萎縮、胃癌發生的起始因素。IL－1βm RNA低表達，胃酸分泌增多，則會導致十二指腸潰瘍的發生。由此可見IL－1βmRNA表達水平對胃腸道疾病的發生發展有著重要的影響。成人中研究發現無論是H.pylori的感染還是IL－1基因簇的多態性都一定程度的影響著IL－1β的表達［5－6］，這些影響因素是否在兒童時期就發揮著顯著的作用，尚不明確，需要進一步研究。在對兒童進行消化道內鏡檢測時，鉗取的粘膜量較少，需要高靈敏度的檢測方法來確定其胃粘膜IL－1β mRNA的表達量。Real－time PCR檢測法的靈敏度高，特異性強［7－8］。因此，本研究著力于建立微量胃粘膜IL－1βm RNA 表達水平 Real－time PCR 檢測法。檢測原理如下［9］：

表4 胃粘膜IL－1βmRNA檢測相關數值

dd CT即2－△△CT是一種檢測目的基因表達水平的相對定量方法，多選取GAPDH 、β－actin等看家基因做內參，檢測目的基因相對于看家基因的表達量，之后用標準品做校準就可以得到目的基因的相對定量值，繼而可以比較不同樣本或組別表達水平的差異。ddCT法的推導過程如下［9］：

用Xn表示第n個循環后的目的基因產物量，X0表示初始目的基因量，Ex表示目的基因的擴增效率，n表示循環數，則：Xn＝X0×（1＋EX）n。

用XT表示目的基因達到設定的閾值時的產物量，CTX表示目的基因擴增達到閾值時的循環數，則：XT＝X0×（1＋EX）CT，X＝KX，Kx為一常數。XT表示目的基因達到設定的閾值時的產物量，CT，X表示目的基因擴增達到閾值時的循環數對內參基因R（endogenous reference），亦有同樣的公式，即 RT＝R0×（1＋ER）CT，R＝KR，KR為一常數。RT表示內參基因達到設定的閾值時的產物量，R0表示初始內參基因量，ER表示內參基因的擴增效率，CT，R表示內參基因擴增達到閾值時的循環數。

目的基因的產物量XT除以內參基因的產物量RT得

對于使用Taqman探針的實時擴增而言，XT和RT的值由一系列因素決定：包括探針所帶的熒光報道基團、探針序列對探針熒光特性的影響、探針的水解效率和純度以及熒光閾值的設定。因此常數K并不一定等于1。假設目的基因與內參基因的擴增效率相同，即＝K或XN×（1＋E）△CT＝K，這里的 XN是就（X0／R0）標準化處理過的初始目標分子量；△CT表示目的基因和內參基因CT值的差異即CTX－CTR。整理得XN＝K×（1＋E）－△CT。

最后用標準品calibrator（cb）的XN校準任一樣本q的 XN，XN，q除以 XN，cb得：

對于少于150 bp的擴增片斷，如果Mg2＋濃度、引物都進行了適當的優化，擴增效率接近于1。因此目的基因經內參及calibrator校準后的量即為

運用建立好的檢測方法成功獲得了20例兒童消化道內鏡檢測時鉗取胃粘膜的IL－1βm RNA相對表達量。本次研究建立的微量胃粘膜IL－1βmRNA表達水平Real－time PCR檢測法，將有助于進一步研究IL－1β在胃腸道疾病發生、發展過程中的作用，特別是在標本量少，IL－1β表達量低的情況下。

此外，IL－1β在個體對多種抗原的侵入反應中發揮作用，它可以提高個體對各種內源性及外源性刺激的免疫力。IL－1β的廣譜生物學作用源自它所介導的許多其它基因的表達如：TNF－α，interferonα，β.γ，c－myc，c－jun，and c－fos［1］，精確定量IL－1β表達還有助于研究它對相關基因的調節作用，本文所建立的方法對血液、體液等微量標本IL－1βmRNA表達水平的檢測同樣適用。

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