P27蛋白及DNA倍體不同表達與結腸癌臨床病理學特征的關系

楊志平，楊文穎，盛 望，郭玉琳，李千迅，楊 卓

（1.北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院 北 京 北 京100124；2.北華大學附屬醫(yī)院消化科，吉林 吉 林132011；3.吉林省人民醫(yī)院，吉林 長 春130021）

結腸癌是高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年上升的趨勢，且預后較差其主要原因是腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移。由于對腫瘤增殖動力學及細胞周期調(diào)控認識的深入，希望從細胞分子生物學水平盡早發(fā)現(xiàn)癌變，以達早期治療目的。p27表達蛋白是一種細胞周期的負性調(diào)節(jié)物，通過影響細胞周期素與cyclin－CDK復合物結合，控制細胞由G1期進入S期的“位點”，從而抑制細胞增殖［1］。目前關于結腸癌DNA倍體類型與臨床病理學特征間的關系尚無定論；而不同分期的消化道腫瘤生物學及臨床特征亦不相同。我們應用流式細胞術測定結腸癌、直腸癌患者腫瘤細胞的DNA含量，探討DNA倍體分析對結腸癌臨床病理學特征的關系，同時應用免疫組織化學SP法對結腸癌組織中p27表達及與腫瘤臨床病理學特征的關系進行了分析。

1 材料與方法

1.1 一般資料

北華大學附屬醫(yī)院及吉林省人民醫(yī)院（2007年5月－2011年4月）結腸癌手術切除標本130例，患者年齡33－88歲，平均年齡56.5歲；男87例，女43例，男：女≈2：1。TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期66例，Ⅲ、Ⅳ期64例；中、高分化70例，低分化60例，均經(jīng)病理學診斷。手術前未行任何抗腫瘤治療。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器及試劑 抗p27鼠抗人單克隆抗體、SP試劑盒，DAB顯色試劑盒（購自福建邁新生化技術開發(fā)公司）；EPICS－XL型流式細胞儀（美國BECKMAN－COULTER公司）；DNA 倍體分析試劑成套產(chǎn)品，PI熒光染料（COULTER公司）。

1.2.2 切片制備 所有標本常規(guī)取材，福馬林固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，用于免疫組織化學染色。

1.2.3 P27蛋白檢測 采用免疫組織化學SP法。以高壓枸椽酸鹽行抗原修復，DAB顯色，胞核、胞漿染為棕色者為陽性細胞。400倍顯微鏡下每張載玻片計數(shù)5個視野，每個視野100個細胞，取陽性細胞數(shù)百分比的平均值，＜50%為低表達，≥50%為高表達。

1.2.4 DNA倍體分析 將留取腫瘤標本，放入4℃生理鹽水中，部分常規(guī)病理檢查，部分進行DNA倍體分析。DNA倍體分析方法如下：去除脂肪組織及血塊，用眼科剪剪成肉糜狀，加入生理鹽水，吹散團塊呈懸液，180目濾網(wǎng)過濾，再用300目濾膜過濾，800～1 000 r／min離心10 min，去上清，加入PBS混勻，在顯微鏡下計數(shù)細胞，使細胞濃度為（3×105）～（3×106）ml－1，再加適量PI染液5～10 min，上機測定。在直方圖上，只有單個G0／G1期單峰的為DNA二倍體，而有2個或者2個以上G0／G1期峰的為DNA異倍體。（DI指數(shù)在0.9～1.1為二倍體，其余為異倍體），正常S期細胞比率＜15%。

1.2.5 統(tǒng)計學處理方法 計數(shù)資料作χ2檢驗，P＜0.05，差異有顯著性。

2 結果

2.1 P27蛋白在結腸癌及癌旁組織中的表達

結腸癌不同部位組織內(nèi)P27高表達率不同，癌灶處P27高表達率最低，離癌灶越遠，P27表達越高。有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 p27在結腸癌及結腸癌旁組織中的表達

2.2 DNA倍體在結腸癌及癌旁組織中的表達

結腸癌組織DNA異倍體與癌旁組織2 cm以內(nèi)及2 cm－5 cm中的DNA異倍率比較，有顯著性差異（P＜0.05）。離癌灶越遠，異倍體DNA表達越低。見表2。

表2 DNA倍體在結腸癌及結腸癌旁組織中的表達

2.3 P27蛋白及DNA倍體不同表達與結腸癌臨床病理學特征之間的關系

由表3可見，結腸癌組織中p27表達水平與結腸癌的惡性程度、TNM分期相關（P＜0.05），惡性程度越高、TNM分期越晚，p27的表達水平越低。

表3 p27表達與結腸癌臨床病理學特征的關系

2.4 DNA異倍體率與腫瘤臨床病理學特征之間的關系

由表4可見，通過統(tǒng)計學分析，DNA倍體類型與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期無明顯的關系（P＞0.05）。但是我們發(fā)現(xiàn)隨著浸潤深度增加、淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期增加及分化越差，異倍體比率呈增高趨勢。

2.5 結腸癌P27蛋白的表達與DNA倍體的關系

由表5可見，P27的表達的降低會導致DNA的多倍體化，r＝0.468（P＜0.05）。

表4 DNA異倍體率與腫瘤臨床病理學特征關系

表5 結腸癌P27蛋白的表達與DNA倍體的關系

3 討論

p27是國外學者研究較多的一種預后因子，是Polyak等［2］于1994年發(fā)現(xiàn)并克隆的參與細胞周期調(diào)控的抑癌基因，定位于人染色體12p。其異常表達活性的改變會影響細胞周期進程［3］。進而影響細胞增殖，其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。p27蛋白是p27基因的產(chǎn)物，p27蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平以化學劑量方式與cyclin－CDK復合物結合，阻止細胞增殖，從而使細胞周期停止在G1期。p27蛋白水平低下或缺失，可導致細胞過度增殖，引起腫瘤發(fā)生。近年國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)［3－5］，在多種消化系腫瘤中，P27Kip蛋白的異常表達與腫瘤的進展和不良預后密切相關.本研究結果顯示：結腸癌不同部位組織內(nèi)P27蛋白高表達率不同，癌灶處P27蛋白高表達率最低，離癌灶越遠，P27蛋白表達越高。目前，在大腸癌中p27蛋白與腫瘤分化關系的報道不一致。本組資料顯示，p27蛋白與腫瘤惡性程度相關，高分化大腸癌中，p27蛋白高表達比例高，低分化大腸癌中，p27蛋白高表達比例低，兩組有顯著性差異；p27蛋白與TNM分期相關，TNM分期越晚，p27蛋白的表達水平越低。這說明p27影響大腸癌分化途徑，促進大腸癌惡性演進，p27的低表達可作為腫瘤惡性程度高的一個指標。我們的結果與Kim等［6］的觀點基本一致。

用流式細胞儀能夠測定腫瘤細胞的很多參數(shù)，分析大量細胞的細胞周期和DNA倍體已經(jīng)廣泛應用于腫瘤基礎和臨床研究中。人體正常的體細胞均具有較恒定的DNA二倍體含量，細胞癌變過程中常伴隨細胞DNA含量的改變，如果DNA含量發(fā)生微小的異常變化，就有可能導致惡性腫瘤。DNA非整倍體細胞是惡性腫瘤的特異性標志之一［7］。從流式細胞儀DNA周期分析可進一步判斷細胞的DNA倍體水平，DNA含量分析對結直腸癌患者的預后判斷已有相關報道，雖然其預后價值尚不能肯定，但多數(shù)研究者認為DNA二倍體腫瘤患者較異倍體患者有較好的生存期［8，9］。也有學者認為DNA倍體與大腸癌Dukes.分期無關［10］，與淋巴轉(zhuǎn)移無關［11］，與組織學類型無關［12］。本研究結果表明：DNA倍體類型與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期無明顯的關系；但是發(fā)現(xiàn)隨著浸潤深度增加、淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期增加及分化越差，異倍體比率呈增高趨勢。因此，測定細胞核DNA含量與倍體分析可以了解細胞增殖狀態(tài)，從而判斷細胞有無惡變傾向或惡性程度，其對惡性腫瘤的早期診斷具有重要價值。同時，P27蛋白表達的降低會導致DNA的多倍體化，兩者呈負相關關系。

綜上，本研究認為，p27蛋白低表達是促進大腸癌惡性演進的因素；P27蛋白的免疫組化檢測結合DNA倍體分析有助于反映結腸癌發(fā)生、發(fā)展、生物學行為和預后，兩者可以作為結腸癌臨床分期和預后的監(jiān)測指標之一。

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