大腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中基因mRNA表達(dá)及其臨床意義

趙金偉，李 韜，馬 震，董 強(qiáng)，王鐘林＊

（1.吉林省人民醫(yī)院 急 診外科；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院09級，吉林 長 春130021）

幾項(xiàng)有關(guān)糞便基因mRNA檢測技術(shù)在結(jié)直腸癌診斷中的研究報告表明，采用RT－PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸癌病人糞便基因的異常表達(dá)對結(jié)直腸癌診斷率較高，但關(guān)于CD44、COX－2、CK－20m RNA在病灶及糞便中表達(dá)是否具有同源性，能否作為CRC的診斷標(biāo)記物有待于研究。

本實(shí)驗(yàn)的目的是通過對COX－2，CK－20，CD44v6m RNA在結(jié)直腸原發(fā)灶及病人糞便中的表達(dá)，證實(shí)糞便中COX－2，CK－20，CD44v6mRNA表達(dá)來源于原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞的脫落所致，為臨床結(jié)直腸癌篩查選擇合適的多基因標(biāo)記物聯(lián)合檢測指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集吉林省人民醫(yī)院及吉林省腫瘤醫(yī)院2008年1月－2010年2月行結(jié)直腸癌根治術(shù)的結(jié)直腸癌原發(fā)灶38例，所有患者術(shù)前均未行抗腫瘤治療，其中，男性20例，女性18例，年齡42－81歲，平均年齡62歲，Duke＇s A、B期13例，Duke＇s C、D期25例。分化程度：高中分化15例，未、低分化23例。患者術(shù)前2－3天在醫(yī)生指導(dǎo)下用帶蓋糞便標(biāo)本盒收集糞便標(biāo)本，在2小時內(nèi)送于實(shí)驗(yàn)室，分裝后－80℃保存，對術(shù)中切除的病變標(biāo)本切取一部分置于標(biāo)本盒內(nèi)，置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＜S便標(biāo)本均為服藥前或灌腸前留取標(biāo)本。

1.1.2 糞便標(biāo)本的預(yù)處理 糞便標(biāo)本解凍后，取成形糞便標(biāo)本3－5克或水樣便100毫升加入100毫升液基細(xì)胞保存液100毫升攪拌均勻后，依次經(jīng)過100目篩網(wǎng)，200目篩網(wǎng)，1200轉(zhuǎn)／分（rpm）離心10min后棄去上清液，加提取液重懸沉淀至50毫升，過300目篩網(wǎng)，1200轉(zhuǎn)／分（rpm）離心10min后棄去上清液，取沉淀加入液基細(xì)胞保存液1.5毫升置于1.5ml Eppendorf管中，上述標(biāo)本處理1小時完成，并置于－80℃冰箱中保存。

1.2 PT－PCR法檢測結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中基因mRNA表達(dá)

1.2.1 總RNA的提取 用DEPC嚴(yán)格處理實(shí)驗(yàn)器材以防止RNA酶污染。解凍組織標(biāo)本或糞便預(yù)處理后的標(biāo)本，研磨后加入PBS洗滌，1000 rpm，5分鐘，棄上清 →加1ml Trizol，室溫放置5分鐘，轉(zhuǎn)到EP管加0.2 ml氯仿重懸沉淀，劇烈振搖，室溫靜置5 min→4℃12000 rpm，離心15 min→上層水相移至另一EP管（寧少勿多）→加入0.5 ml冰異丙醇→充分混勻，室溫放置10 min→4℃12 000 rpm，離心15 min，去上清→加入75%冰乙醇－DEPC1 ml，振搖洗滌沉淀→4℃12000 rpm，離心10 min，棄上清→去乙醇，空氣中干燥RNA→加DEPC水（10－50μl），溶解RNA→所得的總RNA置于－80℃冰箱保存。

1.2.2 RNA純度及完整性檢測 取RNA樣品用紫外－可見光分光光度計于260 nm、280 nm處測定A值，計算RNA濃度和RNA定量。取RNA樣品進(jìn)行甲醛變性，1%瓊脂糖凝膠電泳，拍照，用光密度掃描儀掃描28s和18s條帶，計算密度比值。

1.2.3 引物設(shè)計［1－3］實(shí)驗(yàn)所需引物及內(nèi)參照βactin引物均系上海生工生物工程公司合成，經(jīng)Genebank檢索為特異性引物。DNA Marker采用寶生物工程有限公司DL2000 Marker。

1.2.4 RT－PCR技術(shù)檢測COX－2，CK－20，CD44v6 m RNA表達(dá)

①逆轉(zhuǎn)錄

RNA 4μl＋Oligod T 2μl＋DEPC 10μl—72℃，5分鐘，變性模板RNA—迅速放置冰上，復(fù)性模板RNA—5×buffer 5μl＋10 m Md NTP 2μl＋25u／μl Rnasin 1μl＋200 u／μl mmlv 1μl—42℃，1 h—94℃，5 min—冰上，5 min，置－80℃儲存。

②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

反應(yīng)體系：滅菌去離子水32μl；10×PCR buffer 5μl；10 mmol／Ld NTP 1μl；10pmol上游引物1 μl；10pmol下游引物1μl；cDNA（0.1 ug／μl）1μl。

③Taq DNA 聚合酶（2u／μl）0.2μl增條件

β－actin：取cDNA 2μl，加入10×Bufer 2μl，25 mmol／L氯化鎂溶液 1.2μl，Taq 酶 1 U，22.5 mmol／L d NTPs 0.16μl，β－actin引物0.1μg，加去離子水至20μl進(jìn)行PCP擴(kuò)增。每次設(shè)一管不加樣品cDNA為陰性對照。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30循環(huán)，72℃延長7 min。基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠（含0.1%溴化乙啶）電泳，拍照。

目的基因：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，加入10×PCR Bufer 3μl，目的基因引物20 pmol，β－actin引物4 pmol，Taq DNA酶1 U，DEPC處理過的水至30μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共45循環(huán)。基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠（含0.1%溴化乙啶）電泳，拍照。

1.2.5 結(jié)果判定 圖片中出現(xiàn)305 bp、370 bp、125 bp的條帶分別為COX－2、CK－20及 CD44v6 mRNA表達(dá)陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS10.0處理，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 COX－2mRNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中的表達(dá)

COX－2mRNA在癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中均可表達(dá)，在癌原發(fā)灶組織中COX－2m RNA表達(dá)的陽性率為57.9%（22／38）；COX－2mRNA 在癌患者糞便中表達(dá)的陽性率為47.4%（18／38）；COX－2mRNA在癌原發(fā)灶及糞便中同時陽性表達(dá)率為44.7%（17／38），同時陰性表達(dá)率為39.5%（15／38），同源性為84.2%（32／38）；同源性與異源性相比，差異具有顯著性，p＝1.5×10－5。如表1所示。

表1 COX－2mRNA在結(jié)腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中的表達(dá)

2.2 CK－20mRNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中的表達(dá) CK－20mRNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中均可陽性表達(dá)，在結(jié)直腸癌原發(fā)灶組織中CK－20mRNA表達(dá)的陽性率為52.6%（20／38）；CK－20m RNA在糞便標(biāo)本中的陽性表達(dá)率為55.3%（21／38）；CK－20mRNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便中同時陽性表達(dá)率為44.7（17／38）；36.8%（14／38）同時無表達(dá)，同源性為81.5%（31／38），同源性與異源性相比，差異具有顯著性，P＝0.0001。如表2所示。

表2 CK－20mRNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中的同源性表達(dá)

2.3 CD44v6mRNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中的表達(dá) CD44v6m RNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中均有較高的陽性表達(dá)，在結(jié)直腸癌原發(fā)灶組織中CD44v6m RNA表達(dá)的陽性率為55.3%（21／38）；CD44v6mRNA在糞便標(biāo)本中的表達(dá)陽性率為50.0%（19／38）；CD44v6mRNA 在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中同時陽性表達(dá)率為50（19／38）；44.7%（17／38）同時無表達(dá)，同源性為94.7%（36／38），同源性與異源性相比，差異具有顯著性，P＝1.8×10－8。如表3。

表3 CD44v6mRNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中的同源性表達(dá)

3 討論

結(jié)直腸癌（CRC）是消化道常見的惡性腫瘤，對CRC的研究表明，CRC的癌變機(jī)制和篩選方法是目前消化道腫瘤中最為明確和完善的，在易感人群中進(jìn)行篩查是CRC的主要防治策略之一，業(yè)已證實(shí)，CRC篩查可以明顯減少CRC的發(fā)生，并且，早期診斷及治療可明顯提高患者的生存率。對于結(jié)直腸癌病人的篩查，未來的熱點(diǎn)是在非腸道準(zhǔn)備下易被患者接受的檢查［4］。糞便基因檢測法是檢測患者糞便基因的改變，無侵襲性、無需特殊準(zhǔn)備、且可檢查整個大腸病變，是目前無創(chuàng)性篩查大腸腫瘤病變的研究熱點(diǎn)。

目前，糞便基因mRNA標(biāo)記物的研究剛剛起步，日本學(xué)者對糞便COX－2mRNA檢測分析發(fā)現(xiàn)，COX－2m RNA表達(dá)對結(jié)腸癌診斷的敏感性和特異性分別為90%，100%。但 Wai K等［1］研究顯示，COX－2m RNA表達(dá)在結(jié)直腸癌中的陽性率僅為50%，腺瘤僅為4%，因此，糞便基因mRNA表達(dá)大腸癌診斷有待于進(jìn)一步研究，聯(lián)合檢測糞便多個基因m RNA表達(dá)是否能夠用于大腸癌的篩查也有待于進(jìn)一步研究。目前尚未見有關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)直腸癌患者糞便相關(guān)基因m RNA表達(dá)與結(jié)直腸癌原發(fā)灶腫瘤的相關(guān)性，二部位基因mRNA表達(dá)是否具有同源性等有待于進(jìn)一步證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)采RT－PCR技術(shù)對38例結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中的COX－2，CK－20及 CD44v6mRNA 表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COX－2，CK－20及 CD44V6m RNA 均可表達(dá)于腫瘤原發(fā)灶及患者糞便標(biāo)本中，COX－2mRNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中同時陽性表達(dá)率為44.7%（17／38），同時陰性表達(dá)率為 39.5%（15／38），同源性表達(dá)率為84.2%（32／38），與異源性表達(dá)相比，差異具有顯著性，P＝1.5×10－5，結(jié)果提示，結(jié)直腸癌糞便患者標(biāo)本COX－2m RNA表達(dá)與結(jié)直腸癌原發(fā)灶COX－2mRNA表達(dá)密切相關(guān)，糞便標(biāo)本COX－2m RNA表達(dá)主要來源于結(jié)直腸癌原發(fā)灶脫落細(xì)胞的COX－2mRNA，因此，檢測糞便標(biāo)本COX－2m RNA表達(dá)可以替代原發(fā)灶COX－2mRNA表達(dá)，作為結(jié)直腸癌的一種無創(chuàng)性的糞便基因標(biāo)記物。Yamauchi等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，COX－2在正常大腸上皮細(xì)胞中幾乎完全不表達(dá)，在腺瘤中表達(dá)有所增加，而在大腸癌組織中高表達(dá)，提示COX－2的高表達(dá)可能參與了大腸癌的發(fā)生。因糞便標(biāo)本COX－2m RNA在結(jié)直腸癌中的陽性率僅為47.4%（18／38），為提高糞便標(biāo)本基因m RNA表達(dá)檢測診斷結(jié)直腸癌的檢出率，本實(shí)驗(yàn)對糞便標(biāo)本 CK－20，CD44v6m RNA表達(dá)進(jìn)行了同樣的研究，CK－20m RNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中均可陽性表達(dá)，在原發(fā)灶中的陽性率為52.6%（20／38），在糞便 標(biāo) 本 中 的 表 達(dá) 率 為 55.3% （21／38），CK－20m RNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中同時陽性表達(dá)率為44.7%（17／38），36.8%（14／38）同時無表達(dá)，同源性為81.5%（31／38），同源表達(dá)率與異源性相比，差異具有顯著性，P＝0.0001。結(jié)果提示，結(jié)直腸癌患者糞便標(biāo)本CK－20m RNA表達(dá)與結(jié)直腸癌原發(fā)灶CK－20mRNA表達(dá)密切相關(guān)，糞便標(biāo)本CK－20m RNA表達(dá)來源于結(jié)直腸癌脫落細(xì)胞的CK－20m RNA表達(dá)，因此，檢測糞便標(biāo)本CK－20mRNA表達(dá)可以替代原發(fā)灶CK－20mRNA表達(dá)，作為結(jié)直腸癌的無創(chuàng)性基因標(biāo)記物。既往研究表明，CK－20不同于其它的角蛋白，非常局限于胃腸上皮細(xì)胞，幾乎所有的結(jié)直腸癌均明顯表達(dá)，且在侵襲，轉(zhuǎn)移，擴(kuò)散到其它組織時始終保持穩(wěn)定。但Stefan Wildi等［6］的研究認(rèn)為，對41例結(jié)直腸癌采用Northern雜交技術(shù)，免疫組化及原位雜交技術(shù)檢測CK－20表達(dá)，發(fā)現(xiàn)病灶CK－20表達(dá)不及正常對照組強(qiáng)，為此，本實(shí)驗(yàn)采用RT－PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸癌原發(fā)灶及癌旁正常粘膜組織的CK－20mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌灶CK－20mRNA表達(dá)呈強(qiáng)陽性，而正常粘膜組織呈弱陽性或陰性，與Stefan Wildi的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符，有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。采用 RT－PCR技術(shù)對CD44v6m RNA表達(dá)進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)CD44v6mRNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中均有較高的陽性表達(dá)，CD44v6 m RNA在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的陽性表達(dá)率為55.3%（21／38），在糞便標(biāo)本中的陽性表達(dá)率為50%（19／38），在原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中同時陽性表達(dá)率為50%（19／38），44.7%（17／38）同時無表達(dá)，同源性為94.7%（36／38），同源性與異源性相比，差異具有顯著性，P＝1.8×10－8，結(jié)果提示，結(jié)直腸癌患者糞便標(biāo)本CD44v6mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌原發(fā)灶CD44v6m RNA表達(dá)密切相關(guān)，糞便標(biāo)本CD44v6mRNA表達(dá)來源于原發(fā)灶脫落細(xì)胞的CD44v6m RNA。Wong等［7］報道，結(jié)直腸癌組織及轉(zhuǎn)移組織內(nèi)都有CD44變異的過度表達(dá)，而在正常的結(jié)直腸細(xì)胞內(nèi)未見CD44v6表達(dá)［8］。Yamao等［9］采用RT－PCR和Southern blot技術(shù)檢測糞便脫落細(xì)胞，在所有正常及結(jié)直腸癌病例中均檢測到CD44s，而CD44v6和CD44v10在結(jié)腸癌術(shù)前陽性率分別為68%和60%，術(shù)后陽性率明顯下降，分別為12%和28%，CD44v6分子的表達(dá)在術(shù)后轉(zhuǎn)陰率為88.2%，CD44v10的轉(zhuǎn)陰率為 80%，并且CD44v6和CD44v10均可在Dukes A期患者術(shù)前糞便中檢出。Tatin［10］采用同樣的手段檢測體液，瘺液，糞便及尿液中CD44基因時，發(fā)現(xiàn)它們具有同樣的敏感性。

本研究表明，CD44、COX－2、CK－20m RNA 在結(jié)直腸癌病人原發(fā)灶及糞便中表達(dá)具有較高的同源性，通 過 檢 測 糞 便 標(biāo) 本 中 CD44、COX－2、CK－20m RNA表達(dá)替代檢測原發(fā)灶中CD44、COX－2、CK－20m RNA表達(dá)用于腫瘤的診斷、預(yù)后等，但能否作為CRC的診斷標(biāo)記物有待于研究。

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