熊果酸誘導(dǎo)人白血病HL－60細(xì)胞凋亡作用

趙洪昌，王 瑩，趙文靜

（1.長春急救中心，吉林 長 春130062；2.吉林省肝膽病醫(yī)院）

熊果酸（Ursolic acid，UA），又名烏索酸，烏蘇酸，是存在多種天然植物中的五環(huán)三萜類化合物，如白花蛇香草、山楂、女子貞、夏枯草等，熊果酸具有保護(hù)肝臟、降血脂、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗氧化和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性［1，2］，研究表明熊果酸可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，如人乳腺癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤等［3－6］。關(guān)于熊果酸對人白血病HL－60細(xì)胞的增殖抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作用及相關(guān)機(jī)制尚未見報道，本研究以HL－60細(xì)胞為研究對象，觀察熊果酸對HL－60細(xì)胞的增殖抑制作用及誘導(dǎo)凋亡作用，并采用流式細(xì)胞術(shù)、Western blot技術(shù)研究熊果酸誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為熊果酸的開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

熊果酸為分析純，純度＞99.9%，購自天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所；Annexin V－FITC／PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京鼎國生物公司、Caspase－9／3蛋白活性檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；小鼠抗人Cyt－c、β－actin單克隆抗體美國 Santa Cruz公司，O－lympus熒光顯微鏡 （Olympus，Japan）；Beckman－XL流式細(xì)胞儀（Beckman，USA）。

1.2 方法

1.2.1 UA對HL－60細(xì)胞生長的抑制作用 參考文獻(xiàn)［7］，MTT法測定熊果酸作用48 h對 HL－60細(xì)胞的增殖抑制作用（熊果酸的終濃度為5、10、20、30、40、50μmol／L）。抑制率（inhibition rate，IR）＝（對照組A值－實驗組A值）／陰性對照組A值×100% ，并計算IC50值。

1.2.2 HL－60細(xì)胞丫啶橙（AO）熒光染色 參照文獻(xiàn)［8］方法，不同濃度熊果酸作用48 h后收集HL－60細(xì)胞，A O染色，熒光顯微鏡下觀察 HL－60細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 Annexin V－FITC／PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡 參照文獻(xiàn)［9］方法，不同濃度熊果酸作用48 h后收集HL－60細(xì)胞，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，采用流式細(xì)胞儀測定HL－60細(xì)胞的凋亡情況率。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測HL－60細(xì)胞線粒體跨膜電位（△Ψm） 羅丹明123為帶正電荷的熒光分子探針，具有高度親脂性，當(dāng)細(xì)胞用羅丹明123染色后，其主要分布在細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的線粒體膜區(qū)，檢測細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的熒光強(qiáng)度的強(qiáng)度可間接反映細(xì)胞的線粒體膜電位。參考文獻(xiàn)［10］方法，流式細(xì)胞儀檢測熊果酸作用6 h后的HL－60細(xì)胞線粒體膜電位。

1.2.5 Western Blot技術(shù)檢測 HL－60細(xì)胞胞漿和線粒體中細(xì)胞色C含量的變化 按照參考文獻(xiàn)［11］提取HL－60細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體部分裂解液，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每組取50μg總蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于3%牛血清白蛋白內(nèi)室溫下封閉2 h，1∶1 000稀釋的細(xì)胞色素C單克隆抗體4℃孵育過夜，PBS沖洗后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，DAB顯色觀察細(xì)胞色素C的表達(dá)，β－actin蛋白作為內(nèi)參。

1.2.6 Caspase－3和 Caspase－9的活性檢測 分光光度法檢測Caspase－3和Caspase－9蛋白活性，收集各組細(xì)胞1×106個，按試劑盒說明書操作，測定A405值，以 A405 值 大 小 表 示 Caspase－3 和Caspase－9蛋白活性。該試劑盒的原理是將Caspase－3或Caspase－9蛋白特異性的多肽偶聯(lián)至發(fā)色基團(tuán)，當(dāng)該底物被活化的Caspase－3（Caspase－9）剪切后，偶聯(lián)的發(fā)色基團(tuán)即游離出來，可通過分光光度計測定其吸光值，通過吸光度值的高低間接反映Caspase－3或Caspase－9蛋白的活性。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對HL－60細(xì)胞的增殖抑制作用

實驗結(jié)果顯示：對照組HL－60細(xì)胞生長活躍，經(jīng)5、10、20、30、40、50μmol／L熊果酸作用48 h后，HL－60細(xì)胞生長明顯受到抑制，并呈明顯的劑量依賴性；各劑量組A570值與對照組A570值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），熊果酸作用 HL－60細(xì)胞48 h的IC50為21.5μmol／L。

2.2 熊果酸體外誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡

AO染色后熒光顯微鏡下觀察可見，對照組HL－60細(xì)胞核完整，呈均染綠色熒光，為正常細(xì)胞核的AO染色特征；HL－60細(xì)胞21.5μmol／L 熊果酸作用下，細(xì)胞體積縮小，部分細(xì)胞的細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)凝集，表現(xiàn)為典型的凋亡細(xì)胞學(xué)形態(tài)特點(diǎn)（見圖1）。同時本研究采用Annexin V－FITC／PI雙染法定量檢測凋亡率。21.5μmol／L熊果酸作用48小時后，HL－60細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為（28.96±6.28）%和（20.14±6.53）%，分別與對照組（0.11±0.06）%和（0.06±0.03）%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），研究結(jié)果提示熊果酸可誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡（見圖2）。

Fig.1 The apoptotic HL－60 cells treated with UA for 48 h（×400）

Fig.2 Apoptosis in HL－60 cells induced by UA for 48 h

2.3 熊果酸對 HL－60細(xì)胞線粒體膜電位和Caspase－3和 Caspase－9蛋白活性的影響

與對照組比較，熊果酸作用48 h后HL－60細(xì)胞線粒體膜電位降低，峰值明顯左移，21.5μmol／L熊果酸組和陰性對照組低熒光部分細(xì)胞所占百分比逐漸降低，分別為（58.13±9.25）%和（2.98±1.03）%，差別有顯著性（P＜0.05），見圖3；21.5 μmol／L熊果酸作用下HL－60細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的含量增加，相反，線粒體中的細(xì)胞色素C減少，見圖4，結(jié)果表明熊果酸可能通過觸發(fā)細(xì)胞色素C從線粒體釋放入胞質(zhì)，激活下游的凋亡通路。

Fig.3 The mitochondrial membrane potential of HL－6O cells treated with UA for 48 h

Fig.4 Cyt－c expression in cytosol and mitochondrial of HL－60 cells treated with UA for 48 h

對照組 HL－60細(xì)胞 Caspase－3、Caspase－9活性水平較低，A405值分別為（0.158±0.038）和（0.121±0.034）。在熊果酸作用下，Caspase－3、Caspase－9活性增加，21.5μmol／L 熊果酸作用48 h，A405值分別升至（0.425±0.083）和（0.382±0.074），與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗結(jié)果顯示 熊 果 酸 作 用 下 HL－60細(xì) 胞 Caspase－3和Caspase－9蛋白被活化。

3 討論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康。熊果酸可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，尤其是可以誘導(dǎo)一些耐藥腫瘤細(xì)胞株凋亡，研究還表明熊果酸對正常細(xì)胞毒性作用較小，具有高效低度的生物學(xué)特點(diǎn)，近年來熊果酸的抗腫瘤作用備受關(guān)注［3－6］。熊果酸具有多種生物學(xué)活性的特點(diǎn)，表明熊果酸可能是一個多靶點(diǎn)、多作用機(jī)制的藥物，所以深入研究抗腫瘤作用和機(jī)制對新藥的開發(fā)具有重要的意義。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是多種抗腫瘤藥物的主要作用機(jī)制，通過誘導(dǎo)凋亡消除腫瘤或抑制腫瘤生長已經(jīng)成為癌癥治療的一種策略［12］。本研究結(jié)果表明熊果酸對HL－60細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，熊果酸體外可誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡。研究表明，細(xì)胞凋亡途徑主要有死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑，線粒體凋亡途徑首先是藥物作用下，細(xì)胞線粒體膜電位下降，細(xì)胞線粒體膜電位的下降導(dǎo)致線粒體膜通透性增高，線粒體膜間腔的細(xì)胞色素c釋放入胞漿，胞漿內(nèi)細(xì)胞色素c可作為凋亡誘導(dǎo)因子，與凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf－1）、caspase－9前體、ATP／d ATP結(jié)合形成凋亡體，凋亡小體進(jìn)活化caspase－3，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。本研究結(jié)果表明熊果酸作用下HL－60細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低，胞漿細(xì)胞色素增加，Caspase－9和Caspase－3蛋白活化，實驗結(jié)果表明熊果酸啟動細(xì)胞凋亡的線粒體體途徑，誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究觀察了熊果酸 體外對HL－60細(xì)胞的增殖抑制作用，觀察到熊果酸可以誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡，通過檢測線粒體膜電位、細(xì)胞色素C和caspase－9、3蛋白活性，表明熊果酸通過線粒體體凋亡途徑，啟動和介導(dǎo)了HL－60細(xì)胞的凋亡過程。

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