腫瘤抗原致敏樹突狀細胞干預BALB／c雌性小鼠膀胱癌的研究

邱 實，田洪陽，何 龍，劉 龍＊

（1.沈陽軍區總醫院 泌 尿外科，遼寧 沈 陽110840；2.遼寧醫學院，遼寧 錦 州121000）

膀胱癌是最常見的泌尿系惡性腫瘤之一，近些年來其發病率呈逐年上升趨勢。在臨床上約有75% ～85%的膀胱腫瘤屬于淺表性的惡性腫瘤，而其中90%的膀胱腫瘤病理結果是膀胱移行細胞癌，手術切除后復發率也較高。樹突狀細胞（dendritic cell，DCs）為機體內活性功能最強、且唯一能夠活化靜息狀態下的T淋巴細胞的抗原遞呈細胞［1］。近年來，隨著DC細胞在體外誘導擴增技術的逐漸發展，以及生物學分子技術逐漸應用于DC瘤苗構建方法的發現，DC瘤苗非常有希望成為免疫治療惡性腫瘤有效方式之一。在本次實驗中，我們構建BALB／c雌性小鼠膀胱癌動物模型，在體外利用BALB／c雌性小鼠雙后肢脛骨和股骨的骨髓分離培養和鑒定樹突狀細胞以及制備DC疫苗的方法，并在BALB／c雌性小鼠觀察了DC疫苗治療小鼠膀胱癌的療效，希望能為膀胱癌的免疫治療提供有力的理論學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

小鼠T24膀胱癌細胞株，由本實驗室常規傳代培養，BALB／c雌性小鼠，育齡6～8周，體重在18～22 g之間，購自重慶醫科大學動物實驗中心，為二級清潔動物。用含10% 胎牛血清的RPMI－1640培養液，在5%CO2、37℃條件下常規傳代培養。人重組粒－巨噬細胞集落刺激因子（rhGM－CSF）、人重組腫瘤壞死因子－a（rh TNF－a）和人重組白細胞介素－4（rhIL－4）購買于Peprotech公司。

1.2 主要實驗方法

1.2.1 T24膀胱癌抗原裂解物的制備：取對數生長期T24膀胱癌細胞株離心后42℃溫浴1 h，反復凍融，離心后取上清，－80℃冰箱保存備用。

1.2.2 構建BALB／c雌性小鼠膀胱癌動物模型：隨機取BALB／c雌性小鼠10只，從含有5×105T24膀胱癌細胞株的l ml RPMI－1640培養基中抽取0.2 ml（即1×105）T24膀胱癌細胞），注射在BALB／c雌性小鼠的左側后肢腹股溝皮下的部位。1周后在BALB／c雌性小鼠注射部位的皮下便可以觸及腫瘤樣結節，在2周后，皮下腫瘤的直徑可生長至1 cm左右。在本實驗中，此方法有致瘤成功率80%。

1.2.3 DC擴增培養以及腫瘤抗原致敏DC鑒定方法 在本實驗中，DC提取方法主要參照inaba方法［2］，并在此方法的基礎上稍做改進，詳細過程如下：在無菌條件下，小心游離并提取BALB／c雌性小鼠的雙側后肢股骨和脛骨，沖洗骨髓腔后，將骨髓組織沖碎并溶于0.9%Nacl中，離心，棄上清，加入10 ml無菌水，低滲迫使紅細胞裂解，10 s后加入10%高滲生理鹽水l ml恢復其滲透壓，離心，過濾，記數。0.9%Nacl洗滌2遍，培養基重懸，使細胞密度達到1.5×106／ml，后再加入rm GM－CSF（5 ng／ml）和rmIL－4（3.3 ng／ml），l ml／孔，鋪在24孔板上，后置于CO2培養箱，并在第3天及時更換培養基，補充細胞因子，然后按培養細胞與腫瘤細胞比例為1：5向RPMI－1640培養液中加入腫瘤抗原裂解物，繼續培養16 h，第4天輕輕吹吸下豁附于板底的聚集體，收集備用。取部分收集細胞送鑒定。采用流式細胞儀檢測PE標記的鼠抗人HLA－DR、CD83、CD1a、CD80、CD86抗體；采用自體混合淋巴細胞反應（MLR）檢測DCs對T淋巴細胞的促增殖能力。

1.2.4 DC體內抑制腫瘤效果檢驗實驗第1天，在各組BALB／c雌性小鼠右后肢皮下接種處于對數生長期的T24膀胱癌細胞1×105個。致瘤成功后，選50只BALB／c雌性小鼠并隨機分成五組，第一組：空白對照組；第二組：腫瘤抗原組；第三組：未成熟DC組，第四組：單點注射成熟DC組，第五組：多點多次注射成熟DC組，實驗動物為每組10只。第12天，在第一至第四組BALB／c雌性小鼠皮下分別注射生理鹽水，腫瘤抗原裂解物，未經抗原致敏DC和腫瘤抗原致敏成熟DC，DC注射劑量為1×106／只。然后在BALB／c雌性小鼠荷瘤第14天強化注射一次，注射劑量與上述相同。第12天，在第五組BALB／c雌性小鼠雙側腋窩及腹股溝皮下注射腫瘤抗原致敏成熟DC，2.5×105／部位（總量仍是1×106／只），后在BALB／c雌性小鼠荷瘤分別于第14天，第16天和第18天分別強化注射一次，注射劑量及部位與上述相同。當在BALB／c雌性小鼠皮下部位腫瘤可以觸及后，用卡尺測量腫瘤的橫徑和縱徑，用公式1／6πab2估算腫瘤的體積（a為長軸縱徑，b為短軸橫徑）。后在BALB／c雌性小鼠荷瘤第24天后，采用脫頸法處死BALB／c雌性小鼠，小心完整剝離腫瘤組織，在微量天平稱重。

1.3 統計學分析

使用SPSS 10.0統計軟件，不同試驗組間兩兩比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 DC體外培養與鑒定

DC體外培養第4天，成熟的樹突狀細胞大小為15～20μm，胞體形態變得不規則，細胞表面有樹突樣突起。用流式細胞儀分析檢測顯示，在收獲的成熟DC中，CD11＋DC約為65%，CD80＋為80%，CD86＋為85%，與以前文獻報道結果相似［3］。

2.2 免疫干預效果

2.2.1 腫瘤體積的測量方法 當BALB／c雌性小鼠荷瘤到第24天的時候，空白對照組（單純注射生理鹽水）腫瘤的體積為：（1.123±0.423）cm2；注射腫瘤抗原裂解物組腫瘤的體積為：（0.968±0.542）cm2；注射未成熟DC組腫瘤組腫瘤的體積為（1.056±0.623 cm2）；單點注射腫瘤抗原致敏成熟DC組腫瘤的體積為（0.632±0.423）cm2；多次多點注射成熟DC組腫瘤體積為（0.325±0.231）cm2。腫瘤抗原裂解物組和未成熟DC組與單純注射生理鹽水組之間比較，其結果均沒有統計學意義（P＝0.82和0.68）；而與空白組比較相比，單點注射成熟DC組和多點多次注射成熟DC組的結果具有明顯統計學差意義（P＝0.03和0.002）；單點注射成熟DC組與多點多次注射組間比較統計學也有明顯差異（P＝0.016）（見表1，圖1）。

表1 DC注射部位和頻率對腫瘤體積的影響

2.2.2 BALB／c雌性小鼠處死后腫瘤質量的測定

空白對照組（單純注射生理鹽水）腫瘤的重量為（1.279±0.512）g；注射腫瘤抗原裂解物組腫瘤的重量為（1.142±0.618）g；注射未成熟 DC組腫瘤的重量為（1.201±0.674）g；單點注射腫瘤抗原致敏成熟DC組腫瘤的重量為（0.814±0.524）g；多點多次注射成熟 DC組腫瘤的重量為（0.441±0.315）g。腫瘤抗原裂解物組和未成熟DC組與空白對照組比較，其差異無明顯統計學意義（P＝0.91和0.81）；而與空白對照組比較，單點注射成熟DC組和點多次注射成熟DC組具有顯著統計學意義（P＝0.02和0.001）；單點注射成熟DC組和多點多次注射組間兩組之間比較，其結果也有明顯統計學意義（P＝0.013）（見表2，圖2）。

表2 DC注射部位和頻率對腫瘤重量的影響

3 討論

圖1 DC注射部位和頻率對腫瘤體積的影響

圖2 DC注射部位和頻率對腫瘤體積的影響

樹突狀細胞（DC）是一類廣泛分布在機體內部的獨特細胞，它們吞噬處理抗原并遞呈給T淋巴細胞，進而激發機體免疫系統對致病抗原產生有效的免疫應答，從而起到保護機體免受外來微生物的入侵，并能夠及時清除自體內異常突變的細胞。但常常由于腫瘤微環境DC數目的有限、局部調節DC有效活性物質的不足，以及腫瘤細胞也時常分泌能抑制DC活性功能的細胞因子等原因往往會導致DC抗原提呈能力顯著下降［4，5］。近些年來，國外學者研究發現，采用腫瘤抗原常能在機體外刺激未成熟的DC進入成熟的DC狀態，然后再通過各種有效的途徑重新輸回機體內部，從而起到可以再重新煥起機體內對惡性腫瘤細胞產生各種有效的免疫應答［5－8］。在本次實驗中，我們采用BALB／c雌性小鼠膀胱癌模型為研究對象，在體外觀察腫瘤抗原致敏樹突狀細胞對BALB／c雌性小鼠膀胱癌的治療作用，旨在希望能夠為下一步對腫瘤的臨床免疫學研究奠定理論基礎。

本研究結果顯示，單純注射T24腫瘤抗原不能有效地誘發機體產生抗腫瘤的免疫級聯反應，此結果說明T24膀胱癌細胞株的具有弱免疫原性。而未經T24腫瘤抗原致敏的未成熟DC細胞也不能在機體內產生有效的抑制膀胱癌作用。提示在腫瘤患者機體內部，若DC處在未成熟狀態的時候，由于其表面缺乏共刺激分子表達，進而也不能有效地遞呈抗原，因此，也不能產生有效的免疫應答反應。在本次實驗中，在單部位注射抗原致敏成熟的DC組，抑制小鼠膀胱癌的作用有所提高，腫瘤的重量從（1.279±0.512）g下降到（0.814±0.524）g，其結果具有統計學意義（P＝0.02）。在多部位多次注射成熟DC組，腫瘤的重量從（1.279±0.512）g下降至（0.441±0.315）g，其結果與空白對照和單部位注射抗原成熟DC組比較，均具有具有顯著統計學意義（P＝0.001和0.005）。分析其原因，可能因為多次多部位注射成熟DC可以有效地促進其向局部淋巴結遷移，進而起到增加抑制腫瘤生長的效果。

［1］Wada Y，Cardinale I，Khatcherian A，et al.Apilimod Inhibits the Production of IL－12 and IL－23 and Reduces Dendritic Cell Infiltration in Psoriasis.［J］.PloS One，2012，7 （4）：e35069.

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