預處理舒芬太尼對缺血大鼠心肌細胞凋亡的影響及相關Bcl－2、Bax蛋白的表達

李曉錄，趙國慶，高 明

（吉林大學中日聯誼醫院 麻醉科，吉林 長春130033）

舒芬太尼以其對血流動力學干擾較輕，起效快，消除半衰期較短.鎮痛效能更強的特點倍受臨床醫生的青睞，廣泛應用于臨床，尤其適用于心血管手術麻醉。現已證實預處理舒芬太尼可減輕心肌缺血再灌注損傷［1］，對心肌有保護作用，但其對心肌細胞凋亡的影響卻鮮有報道。本實驗旨在通過檢測大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白的表達情況，以探討舒芬太尼預處理與心肌細胞凋亡的關系，為心臟手術和心臟病人非心臟手術圍術期用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型的制備 健康雄性SD大白鼠40只，體重200－300g。所有實驗大鼠術前均禁食12h，可自由飲水。大鼠稱重、麻醉后固定于實驗臺，于大鼠胸骨左緣第3－4肋間逐層鈍性分離開胸，暴露心臟，剪開心包膜，在左心耳下方1－2mm處以線做套環，穩定15min以備實驗用。收緊結扎線即形成左冠狀動脈閉塞心肌缺血，松開結扎線即形成再灌注。心肌缺血成功標志為：心電圖ST段明顯抬高并且結扎線以下心肌組織顏色由正常變蒼白再變暗。

1.2 分組與處理 所有實驗大鼠隨機分為4組，每組10只。①假手術組（（S組空白對照），開胸后穿線做套環，但不結扎；②單純缺血再灌注組（I／R組），結扎缺血30min，放松結扎線后行再灌注120 min；③缺血預處理組（IPC組），采取結扎左冠狀動脈前給予三次5min缺血、5min再灌注，而后操作重復I／R組；④預處理舒芬太尼組（SPC組），于結扎左冠狀動脈前分別采用微量泵靜脈泵注舒芬太尼（0.5μg／kg）5min、停5min，重復預處理3次，以后操作同I／R組。

1.3 指標觀察 心肌細胞凋亡檢測：具體步驟按心肌細胞凋亡的原位末端標記檢測（TUNEL）法說明書進行。光鏡下觀察，細胞核呈棕褐色染色即為TUNEL陽性。凋亡細胞記數時，采用ImagePro Plus 4.5圖象分析軟件，隨機選取5個無重疊之高倍鏡視野（40X），計數其凋亡陽性細胞核數及總細胞核數，按公式［凋亡指數（AI）＝凋亡心肌細胞核數／心肌細胞核總數X 100%］計算心肌細胞凋亡指數，取其平均值即為心肌細胞凋亡率。

免疫組織化學法檢測心肌組織Bcl－2、Bax蛋白含量：取心尖上1 mm處心肌常規制備石蠟切片，免疫組織化學具體步驟按PV二步法說明書進行。Bcl－2、Bax蛋白表達結果的觀察：光鏡下，細胞漿呈棕黃色或棕褐色染色的即為陽性，不染色者為陰性。采用ImagePro Plus 4.5圖象分析軟件半定量分析Bcl－2和Bax的表達量，在校正光密度后每張切片隨機取5個高倍鏡（40X）下無重疊之視野，測定其陽性反應的平均光密度（OD），以平均光密度（OD）代表含量密度。

1.4 統計學處理 計量資料用均數±標準差（±s）表示，用 SPSS13.0統計軟件處理。用one－way ANOVA方法進行組間統計學分析比較。P＜0.05有統計學差異，P＜0.01為有非常顯著統計學差異。

2 結果

2.1 各組大鼠缺血再灌注心肌TUNNEL細胞計數各組心肌細胞凋亡指數結果分析可見，與S組比較其余三組凋亡指數明顯增高（P＜0.01），與I／R組比較IPC組和SPC組心肌細胞凋亡指數明顯降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠缺血再灌注心肌TUNEL染色結果各組切片在光鏡下均可見到TUNEL陽性細胞，其中S組僅呈散在少量分布，而其余三組在心肌缺血／再灌注后則明顯增多，尤以I／R組凋亡心肌細胞數量增多明顯，且成群分布。IPC組和SPC組凋亡心肌細胞明顯少于I／R組，介于S組與I／R組之間（圖1）。

表1 各組大鼠心肌細胞凋亡變化的比較

2.3 Bcl－2、Bax蛋白免疫組化染色及半定量分析光鏡下可見陽性的Bcl－2蛋白在胞漿內呈棕褐色片狀表達，而Bax蛋白則積聚于胞漿內，呈棕黃色染色。與S組相比，其余三組Bcl－2、Bax蛋白的表達明顯增多，OD值顯著增高，組間比較差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。IPC組和SPC組的Bcl－2蛋白表達OD值明顯高于I／R組，而Bax蛋白表達OD值則顯著降低（P＜0.01）。Bcl－2／Bax蛋白表達的比值，I／R組明顯低于S組 （P＜0.01or P＜0.05），IPC組與SPC組顯著高于I／R組 （P＜0.01）（表1，圖2，3）。

圖1 TUNEL染色結果 （A：S組 偶見散在的棕色凋亡細胞；B：I／R組 凋亡細胞成群分布；C：IPC組 棕色凋亡細胞明顯減少；D：SPC組 棕色凋亡細胞散在分布）

圖2 Bcl－2免疫組化（40×）（鏡下可見Bcl－2蛋白表達呈棕褐色，分布于胞漿。A：S組；B：I／R組；C：IPC組；D：SPC組）

圖3 Bax免疫組化，（40×）（鏡下可見Bax蛋白表達呈棕黃色，分布于胞漿中。A：S組；B：I／R組；C：IPC組；D：SPC組）

3 討論

心肌缺血／再灌注損傷（MIRI）是一種比較復雜且廣泛的病理生理過程，缺血的心肌在恢復其血供的過程中會增加心肌原有的損害，嚴重影響缺血后心臟功能的恢復，對圍術期病人的生活質量甚至生命造成巨大的威脅。細胞凋亡，又稱細胞程序性死亡（programmed cell death），近年來研究表明其在誘發心肌缺血再灌注損傷的過程中發揮重要作用［2］，因此如何減少細胞凋亡就成為擺在我們面前的首要難題。

本實驗病理結果觀察到S組偶見凋亡細胞，I／R組出現大量的心肌細胞凋亡，而IPC和SPC組細胞凋亡明顯少于I／R組，可見，心肌缺血再灌注損傷有加重心肌細胞凋亡的作用。通過對4組大鼠心肌細胞凋亡指數的比較，我們不難看出IPC和SPC組的心肌細胞凋亡指數明顯低于I／R組，說明缺血預處理與舒芬太尼預處理均有相同的心肌保護作用。雖然IPC組的心肌細胞凋亡指數較SPC組略低，但缺血預處理本身是一種損傷因素，有其局限性，臨床應用價值較低，因而預處理舒芬太尼就成為心肌保護的首選。

細胞凋亡受多種調節基因的控制，在與細胞凋亡有關的基因中，Bcl－2家族是重要的抗凋亡基因，在MIRI中起主導地位，其中Bcl－2是最主要的抗凋亡基因，而Bax的作用則正好相反，其表達則可促進細胞凋亡。兩者的比值決定著細胞是否發生凋亡。本實驗結果顯示IPC組與SPC組的Bcl－2蛋白表達均較I／R組明顯升高，而Bax蛋白表達則明顯降低，Bcl－2／Bax比率較I／R組明顯上升，再次說明兩種預處理方法均有抗凋亡作用，均可通過上調Bcl－2蛋白與下調Bax蛋白的表達，以達到抗凋亡的目的。

阿片類藥物抗心肌細胞凋亡的機制，可能是通過激活心肌細胞δ受體，從而激活細胞外信號調節激酶，促進細胞內生存素的表達，從而促進Bcl－2表達和抑制Bax表達，同時開放線粒體ATP敏感性鉀通道，從而抑制細胞凋亡［3］。在阿片類制劑中舒芬太尼的鎮痛效應最強，其主要激動μ受體，同時也激動δ、κ阿片受體，本研究推測舒太尼預處理可能通過激活心肌δ受體，調節Bcl－2與Bax蛋白的表達發揮其抗凋亡作用，對心肌的MIRI損傷產生保護作用。

心肌低灌注、缺血和復流、再灌注損傷是心臟手術與心臟病人非心臟手術圍術期發生各種心臟危險事件的最常見原因。結合本實驗的研究結果我們不難看出，舒芬太尼有較強的心肌保護作用，在圍術期預處理舒芬太尼可預防心肌缺血，增加心肌對缺血的耐受力，顯著降低各種心臟危險事件的發生，提高手術安全及預后，有極其廣泛的臨床應用價值。

［1］張冬梅，侯春麗，常業恬，等.舒芬太尼預處理對缺血再灌注大鼠心肌梗死范圍及心肌酶的影響［J］.實用醫學雜志，2009，25（15）：2430.

［2］Freude B，Masters TN，Robicsek F.et al.Apoptosis is initiated bymyocardial ischemia and executed during reperfusien［J］.J Mol Cell Cardiol，2000，32（2）：197.

［3］Yao LL，Wang YG，Cai WJ，et al.Survivin mediates the anti—apoptoticeffect of delta—opioid receptor stimulation in cardiomyocytes［J］.J Cell Sci，2007，120：895.