NKT細胞通過IL－10參與誘導小鼠心臟移植免疫耐受

王遠濤，王偉剛，王 鋼，周洪瀾，高寶山，安 偉

（吉林大學白求恩第一醫院 泌 尿系統疾病診治中心，吉林 長 春130021）

NKT（Nature killer T cells）細胞是一種具有NK細胞特點的T細胞。它是一種獨特的細胞亞群，兼有NK細胞和T細胞兩種性質［1－3］。NKT細胞活化后能迅速分泌大量的IFN－γ和IL－4［4］。因此，NKT細胞在機體免疫自穩、抗感染和抗腫瘤以及移植免疫等諸多方面發揮重要作用。但其在誘導免疫耐受過程中的具體作用，仍不十分清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取BALB／c小鼠作為供者，C57BL／6小鼠作為受者，約6－8周齡，體重15－20 g，所有試驗小鼠均為雌性且購于吉林大學第一醫院動物實驗中心。

1.1.2 手術器械及試劑 單人雙目手術顯微鏡一臺購于深圳瑞沃德公司；顯微外科手術器械若干，購自德國ROBOZ公司；鼠NKT isolation kit購自BD公司；IL－10、IFN－γELISA 檢測試劑盒購自 BD 公司；10－0血管縫合線購自美國Ethicon；6－0醫用絲線購自上海醫用縫合廠；4%水合氯醛由吉林大學基礎醫學院提供；CD40L抗體購自ABCAM。MLR緩沖液及MACS緩沖液由吉林大學第一醫院泌尿系統疾病診治中心研究室配置。

1.2 方法

1.2.1 供體手術 供體采用4%水合氯醛（10μl／g）腹腔注射麻醉。經下腔靜脈靜推注1%的肝素鹽水0.3 m L，使供體小鼠全身肝素化。沿胸骨中線剪開胸骨頸部，充分暴露心臟并迅速噴灑冰鹽水降溫。迅速結扎下腔靜脈。充分游離肺動脈及主動脈并剪斷，其余血管及組織于近心臟側集束結扎并切斷。取下供心，置于4℃生理鹽水中保存備用。

1.2.2 受體手術 小鼠麻醉滿意后，固定于鼠板上。腹部經正中切口單層進腹，游離下腔靜脈及腹主動脈周圍結締組織，血管夾同時阻斷下腔靜脈及腹主動脈，供心主動脈和受體腹主動脈行端側吻合，供心肺動脈和下腔靜脈行端側吻合，單層連續縫合關閉腹腔。燈下保溫至小鼠蘇醒。術后通過腹部移植心觸診，觀察移植心存活情況，以指尖不能觸及移植心明顯跳動作為排斥標準。

1.2.3 免疫耐受誘導及實驗分組 選取BALB／c小鼠作為供者，C57BL／6小鼠作為受者。排斥組：單純行心臟移植，無其他處理；耐受組：受鼠于術前7天接受C57BL／6來源脾細胞（1×107個／只）尾靜脈注射，并分別于術前7天、5天、3天，接受抗CD40L抗體腹腔注射（250μg／只／次）。

1.2.4 NKT細胞的制備 NKT細胞分選采用MACS免疫磁珠分選法。簡述如下：供體脾細胞制備成脾細胞懸液，重懸于MACS緩沖液中，加入一抗后孵育10分鐘，洗滌后加入二抗孵育15分鐘，洗滌后過MACS陽性分選磁柱。具體操作過程根據試劑盒說明書。

1.2.5 混合淋巴細胞實驗 30 Gy照射的BALB／c小鼠全脾細胞作為刺激細胞，C57BL／6小鼠全脾細胞作為反應細胞，4×105個細胞／空加入96孔板，刺激細胞與反應細胞的比例為1∶1。選取排斥組移植后第10天的受鼠脾細胞及耐受組移植后50天的受鼠脾細胞，MACS分別分選出NKT細胞作為抑制細胞，2×105個細胞／空加入到反應體系，共同孵育3天，每孔加入3H－Td R 0.5μCi后繼續培養16 h，多頭細胞收集器收集細胞后用全自動液體閃爍器計數。用特異增殖孔和對照孔的平均cpm值，以增殖指數表示各組反應細胞的增殖情況（特異增殖孔的cpm均值／對照孔的cpm均值）。

1.2.6 細胞因子檢測 NKT細胞作為反應細胞，制備如上所述，2×104／孔加入96孔板；100 ng／m L的a－GalCer刺激BALB／c全脾細胞4小時后，30 Gy放射線照射，處理后的細胞作為刺激細胞，4×104／孔與反應細胞共培養3天，ELISA檢測上清中IL－10、IFN－γ含量。具體操作過程見說明書。

1.2.7 統計學分析 采用GraphPad 5.0軟件統計，用t檢驗比較組間差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 移植心存活狀況

排斥組小鼠移植心平均存活時間（MST）為8天；與對排斥組比較，采用供體脾細胞尾靜脈注射結合CD40L封閉誘導免疫耐受組，既耐受組移植心存活時間顯著延長（P＜0.05）。見圖1。

圖1 小鼠心臟移植物存活時間比較

2.2 混合淋巴細胞反應結果

如前述，BALB／c小鼠全脾細胞作為刺激細胞，C57BL／6小鼠全脾細胞作為反應細胞，并選取排斥組移植后第10天的受鼠脾細胞及耐受組移植后50天的受鼠NKT細胞作為抑制細胞，觀察NKT細胞的抑制功能。

對照組：只有刺激細胞及反應細胞；排斥組NKT：除有刺激細胞和反應細胞外，還加入排斥組術后第10天的NKT細胞；耐受組NKT：除有刺激細胞和反應細胞外還加入耐受組術后50天的NKT細胞。結果顯示：沒有加入任何NKT細胞的對照組，淋巴細胞增殖反應明顯；加入排斥組NKT細胞的淋巴細胞增殖反應略有降低，但與對照組比較沒有顯著差異；而加入耐受組NKT細胞的淋巴細胞增殖反應明顯受抑制，與對照組及排斥組比較差別具有顯著性（P＜0.000 1）。見圖2。

2.3 不同組NKT細胞的細胞因子分泌情況

排斥組取術后第10天的NKT細胞，耐受組取術后50天的NKT細胞檢測其IL－10、IFN－γ的分泌情況。結果顯示：與排斥組比較，耐受組NKT細胞分泌了大量的IL－10，P＜0.001；同時與排斥組比較，耐受NKT細胞組分泌的IFN－γ明顯減少，P＜0.000 1。見圖3。

3 討論

圖2 不同組NKT細胞抑制淋巴細胞增殖反應情況

圖3 不同組NKT細胞IL－10、IFN－γ的分泌情況

同種異體移植排斥反應是引起移植物失功的主要原因，也是移植免疫領域所要解決的主要問題。已有研究表明：NKT細胞對免疫耐受的誘導具有調節功能。Yang等［5］通過阻斷CD40／CD40L共刺激途徑誘導野生型受體小鼠胰島移植物長期存活，而NKT細胞缺陷者的平均生存時間明顯縮短，過繼性輸注活化的NKT細胞后又可產生免疫耐受。另有研究表明［6］，在口服抗原誘導免疫耐受過程中，耐受組NKT細胞及CD4＋CD25＋CTLA－4＋T細胞數量增加，免疫調節功能增強，考慮NKT細胞抑制了效應性T細胞，同時又有助于調節性T細胞的產生，進而延長了心臟移植物的存活時間。本研究中，應用供體抗原特異性輸注結合CD40L共刺激因子封閉，成功誘導了全錯配小鼠心臟移植物的免疫耐受，而在NKT細胞抑制淋巴細胞增殖反應的試驗中，可以明顯的看出，耐受組NKT細胞具有很強的抑制淋巴細胞增殖的能力，這也在一定程度上說明了NKT細胞的抑制作用可能與細胞－細胞接觸性抑制有關。

NKT細胞所分泌的細胞因子在誘導免疫耐受中的作用尚不十分明確。有研究表明，NKT細胞在阻斷共刺激誘導小鼠同種異體心臟移植免疫耐受中扮演了關鍵的角色，其功能主要與IFN－γ有關［7］。另有研究表明［8－10］：NKT細胞的免疫調節功能主要與IL－10、IL－4的分泌有關。也有其他領域的研究顯示NKT細胞對效應性T細胞的調節作用不需要IL－4、IL－10等細胞因子的參與。在本項研究中可以明顯看出，排斥組NKT細胞主要分泌了大量的IFN－γ，而耐受組NKT細胞分泌的IL－10明顯增加，提示NKT細胞可能主要通過IFN－γ誘導移植物排斥，而主要通過IL－10誘導免疫耐受。

NKT細胞在免疫調節中的作用已成了國內外移植免疫學者關心的前沿領域，并且展現出了誘人的前景，本研究也為NKT細胞在誘導移植免疫耐受中的作用提供了新的證據和思路。

［1］Nicol A，Nieda M，Koezuka Y，et al.Human invariant V al－pha24＋ natural killer T cells activated by alpha－galactosylce－ramide（KRN7000）have cytoxic anti－tumour activity through mechanisms distinct from T cells and natural killer cells［J］.Immunology，2000，99（2）：229.

［2］Kawano T，Cui JQ，Koezuka Y，et al.Analysis of human Vα24＋CD4＋ NKT cells activated byα－galactosylceramide pulsed monocytederived dendritic cells［J］.J Immunol，2000，164：4458.

［3］Nieda M，Nicol A，Koezuka Y，et al.Activation recognition of human Vα24NKT cells byα－glycosylceramide in a CD1d restricted and Vα24 TCR－mediated manner ［J］.Hum Immunol，1999，60（1）：10.

［4］Godfrey DI，Hammond KJ，Poulton LK，et al.NKT cells：facts，functions and fallacies［J］.Immunol Today，2000，21（11）：573.

［5］Yang SH，Jin JZ，Lee SH，et al.Role of NKT cells in allogeneic islet graft survival［J］.Clin Immunol，2007，124：258.

［6］Li W，Carper K，Perkins JD.Enhancement of N KT cells and increase in regulatory T cell s results in improved allograft survival［J］.J Surg Res，2006，134：10.

［7］Seino K，Fukao K，Muramoto K，et al.Requirement for natural killer T（NKT）cells in the induction of allograft tolerance［J］.PNAS，2001，98：2577.

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［9］Jiang X，Kojo S，Harada M，et al.Mechanism of N KT cell－mediated transplant tolerance［J］.Am J Transplant，2007，7：1482.

［10］Haeryfar SM，Lan Z，Leon－Ponte M，et al.Prolongation of cardiac allograft survival by rapamycin and the invariant natural killer T cell glycolipid agonist OCH.［J］.Transplantation，2008，86：460.