CCK法檢測紫草素及衍生物對血液腫瘤細胞株的增殖抑制作用

鐘濟華，成玲劍，周 文，張義煒，鐘 華，黃洪暉，陳芳源＊

（1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院 血液科，上海200001；2.上海交通大學藥學院，上海200240）

紫草為傳統中藥，具有廣泛的藥理作用，抗瘤作用是其中之一。天然紫草素結構中，萘醌環對其藥物活性非常重要，但因其結構本身易通過氧化還原產生活性氧，導致細胞毒作用較大且易殺傷正常細胞，限制了其在臨床上的應用。為了提高紫草素類化合物的抗癌活性，增加其選擇性，人們在天然紫草素的基礎上進行結構修飾與改造，合成了一些紫草素衍生物，它們大多集中側鏈的不同位置加入各種基團，比如硫醚、硫酯、醚、酯等，研究發現這些人工改造和修飾得到紫草素及衍生物能不同程度改善其抗腫瘤作用性狀［1－3］。本研究用 Cell Counting Kit－8（簡稱 CCK－8）法測定天然紫草素 （shikonin，SK01），天 然 β－羥 基－異 戊 酰 紫 草 素 （β－hydroxyisovalerylshikonin，SK17）及其16種人工半合成的紫草素衍生物對常用血液腫瘤細胞株的增殖作用即藥物半數抑制濃度（50%concentration of inhibition，IC50），從中篩選出高效低毒的紫草素類化合物，以期為紫草素及衍生物對血液腫瘤的進一步實驗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：HL－60細胞株（人急性髓系白血病），NB4細胞株（人急性早幼粒白血病細胞），Raji細胞株（人Burkitts淋巴瘤細胞），U937細胞株（人單核細胞系白血病細胞），THP－1細胞株（人單核細胞系白血病細胞），293T細胞株（人正常腎上皮細胞系）均來自本實驗室，于液氮中保存，復蘇后使用。

1.1.2 藥物 紫草素、β－羥基－異戊酰紫草素及其衍生物（表1，圖1）由上海交通大學藥學院李紹順教授饋贈，以純品存于－80℃冰箱中。使用時溶于二甲基亞砜（DMSO：中國醫藥集團上海化學試劑公司）中，配成8 000μg／ml的儲存液備用，然后用培養液稀釋成工作濃度。

圖1 紫草素及SK17結構

1.1.3 主要試劑與儀器 RPMI1640培養液（GIBCO公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK－8試劑盒（同仁化學研究所）；酶標儀（Thermo Labsystems，Multiscan MK－3）。

表1 紫草素、β－羥基－異戊酰紫草素及其16種衍生物的名稱及分子量

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：細胞株以2×105／ml的起始濃度接種于含10%小牛血清的RPMI－1640培養液37℃、5%CO2條件下培養傳代，選取對數生長期細胞用于實驗研究。

1.2.2 CCK－8法測細胞增殖：取對數生長期細胞，制成2×105／ml懸液，按每孔100μl加入96孔培養板中，實驗設空白對照組和陰性對照組及5種不同濃度藥物組，終濃度分別為0.02、0.1、0.5、2.5、12.5μg／ml，每一濃度設4個復孔，置37℃、5%CO2的培養箱中培養。48 h后取出96孔板，加入10μl的CCK－8，在相同條件下繼續孵育1－4 h后，用酶標儀于490 nm處測定各孔的吸光度值，參比波長620 nm。實驗重復3次，按（A對照－A實驗）／A對照×100%計算藥物對細胞的生長抑制率及IC50值。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計分析軟件，結果均以表示。

2 結果

SK01、SK17對上述5種血液腫瘤細胞株及正常細胞株均有很強的細胞毒作用；紫草素－二甲醚衍生物SK36對上述5種血液腫瘤細胞株亦有很強的細胞毒作用，但對正常細胞株的毒性作用則明顯低于SK01和SK17，表現出較好選擇性。6種紫草素衍生物：SK11、SK12、SK13、SK37、SK40、SK42對一種或多種血液腫瘤細胞株有細胞毒作用且對正常細胞株293T無毒性作用；8種紫草素衍生物：SK14、SK15、SK16、SK32、SK33、SK41、SK48以及SK49，對上述5種血液腫瘤細胞株及正常細胞株均無細胞毒作用，IC50＞12.5μg／ml。實驗中我們還發現大部分母核I衍生物抗腫瘤活性強于母核Ⅱ衍生物（表2）。

表2 SK01、SK17及其16種衍生物對6種細胞株的IC50值（μg／ml，n＝3，）

表2 SK01、SK17及其16種衍生物對6種細胞株的IC50值（μg／ml，n＝3，）

IC50 NB4 U937 HL－60 Raji THP－1 293T 12.5 SK12 4.23±0.04 10.96±0.08 3.76±0.00 1.64±0.07 ＞12.5 ＞12.5 SK13 7.47±0.06 3.39±0.009 1.09±0.01 ＞12.5 1.91±0.02 ＞12.5 SK14 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK15 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK16 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK17 1.73±0.01 0.93±0.01 0.78±0.03 3.02±0.01 0.75±0.06 9.59±0.26 SK32 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK33 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK36 3.26±0.08 0.86±0.02 0.90±0.27 5.92±0.056 1.02±0.19 ＞12.5 SK37 4.63±0.07 1.70±0.38 6.47±0.70 11.33±0.01 ＞12.5 ＞12.5 SK40 ＞12.5 ＞12.5 2.39±0.05 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK41 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK42 8.81±0.06 9.88±0.07 6.70±0.08 ＞12.5 ＞12.5 11.00±0.30 SK43 ＞12.5 ＞12.5 8.28±0.09 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK48 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK49 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK01 0.83±0.03 1.02±0.02 0.27±0.01 1.63±0.0 SK 118.49±0.01 2.80±0.08 1.58±0.04 ＞12.5 9.50±0.82 ＞1 1.60±0.09 2.32±0.07

3 討論

上海交通大學藥學院共設計合成了紫草素（SK01），β－羥基－異戊酰紫草素（SK17）及16種的紫草素衍生物，通過波譜分析確定了其化學結構。這16種紫草素衍生物是以SK01、SK17為先導化合物，旨在降低SK01、SK17泛細胞毒作用，針對其結構和藥效特點，對其進行了化學結構修飾與改造。由表1，圖1可見本文所設計紫草素衍生物主要集中在萘醌環羥基、側鏈羥基引入不同類型酸以及萘醌環與側鏈的鏈接位置改變。

盡管許多體內外研究表明［4］紫草素側鏈1’位置引入不同酯基與抗腫瘤作用的增加有關，然而本實驗所測試化合物并未呈現明顯趨勢與規律。從表2可以看出，紫草素母核羥基甲基化能有效降低細胞毒性，提高其對正常細胞293T的選擇性，如SK11、SK12相對于SK01；然而側鏈羥基引入不同酸，有的增強其抗腫瘤活性如SK36，SK37，相反有的其細胞毒作用稍微降低如SK42，有的甚至失去作用如SK14，15，16，32，33，40，41等，表現出與以前針對其它細胞株具有不一樣的抗腫瘤構效關系。對所測腫瘤細胞株顯示有活性的化合物來說，顯示大部分母核I衍生物的活性好于母核Ⅱ衍生物。值得一提是，SK36，SK37的抗腫瘤活性較其它化合物的活性強得多，可能與引入酸中含有β－羥基有關，這趨勢得到相關文獻報道［5，6］的支持。

本文采用的CCK－8法是一種目前廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測法。與其它檢測法相比線性范圍更寬，檢測靈敏度更高、更加穩定并且它對細胞無明顯毒性，可以在不同時間反復用酶標儀讀板，使檢測時間更加靈活，便于找到最佳測定時間［7，8，9］。本實驗選用的細胞株均為懸浮細胞，通過檢測，我們認為CCK－8法應用于血液腫瘤懸浮細胞增殖實驗，其最佳檢測波長為490 nm，參比波長為620 nm；最佳檢測時間為加入CCK－8試劑后2 h［對照組吸光度（A）大于等于1小于2即可］；適宜細胞數量范圍為2×105／ml懸液。

本實驗結果顯示紫草素衍生物SK36對多種血液腫瘤細胞株有很強的細胞毒作用，但在對正常細胞293T的作用方面，SK36的毒性作用則明顯低于SK01和SK17，提示人工半合成的紫草素衍生物SK36與天然紫草素及天然β－羥基－異戊酰紫草素相比較更為安全。已有實驗證明人工半合成的紫草素衍生物具有比天然紫草素更強的抑制白血病等腫瘤細胞增殖的作用，在抗白血病方面，具有開發為一種新的高效低毒藥物的潛能［10］。此外，上述還有一些紫草素衍生物目前在藥物濃度0.02μg／ml－1.5μg／ml范圍內都無明顯活性，但如增大劑量、改變給藥途徑，并不排除從中發現有效藥物的可能性。同時我們還可以采用通過體內動物模型的方式進行進一步的篩選。

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