色滿卡林對培養乳鼠心肌細胞H／R損傷的保護作用研究

祝春梅，王國賢，張 濤

（1.遼寧醫學院附屬第一醫院，2.遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧 錦 州121000）

色滿卡林（CRK）是傳統的鉀通道開放劑，具有舒張血管、降低血壓、保護心臟的作用，用于高血壓和心肌缺血的治療，但其作用機制尚未完全闡明［1－3］。本研究在建立原代培養大鼠乳鼠心肌細胞H／R損傷模型的基礎上，觀察CRK對受損心肌細胞的保護作用，并對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：選用出生2－3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不拘，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2003－0008。主要設備：CO2孵育箱、全自動生化分析儀、倒置顯微鏡、79－1磁力加熱攪拌器、JY2型超聲細胞粉碎儀、721紫外分光光度計、流式細胞儀。主要試劑：CRK（Sigma）、DMEM 培養基（Gibco）、新生牛血清（北京華美生物工程公司）、LDH檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）、Annexin V－FITC凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術有限公司）、Caspase－3抗體（Cell Signaling公司），其余試劑均為國產分析純。

1.2 心肌細胞分離培養 取出生2－3 d的SD大鼠乳鼠，無菌條件下，開胸剪取心臟，剪成1 mm3的小塊后用0.08%胰蛋白酶消化液消化10 min，重復以上過程4－6次，1 000 r／min離心10 min后棄上清，加入含15%小牛血清的DMEM培養基混懸沉淀的細胞，置入CO2孵箱，37℃條件下培養2 h，以差速貼壁分離法純化心肌細胞。調整細胞濃度至1×106個／ml，接種到培養瓶內，常規培養，第三天加藥。

1.3 心肌細胞H／R損傷模型的制備 缺氧：將細胞置入37℃、95%N2＋5%CO2飽和的細胞培養箱培養2 h；復氧：將細胞置入37℃、5%CO2飽和的細胞培養箱中繼續培養30 min。

1.4 實驗分組 將常規培養3 d的心肌細胞分為5組：①正常對照組：細胞正常培養，不施加任何處理因素；②H／R組：缺氧2 h，復氧30 min；③用藥組：三組中分別加入終濃度為2.5、5、10μmol／L的CRK，即刻缺氧2 h，復氧30 min。

1.5 細胞培養液中LDH活性測定 收集各組細胞培養液，用LDH試劑盒并按其說明書進行操作，各種液體加好后，用721紫外分光光度計測各組液體的吸光光度值（檢測波長440 nm），用公式計算出LDH的釋放量，檢測LDH的活性。

1.6 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率 各組細胞先用0.125%胰蛋白酶消化細胞，調整細胞濃度至1×106個／ml，離心并棄上清；加入預冷的PBS震蕩重懸，離心去上清。加入含10μl Annexin V－FITC和5μl PI的Binding Buffer 200μl，混勻后室溫避光反應15 min，再加入Binding Buffer 300μl上機檢測。

1.7 Western blot分析caspase－3蛋白表達水平

心肌細胞給予各組藥物處理培養后，用細胞刮刀刮下細胞，用PBS洗兩遍，離心，棄上清，將心肌細胞放置于－70℃冰箱中備用，測定指標時取出樣品，每份樣品取樣50μg，變性的SDS－聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，電壓積壓80 V，分離膠120 V，半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，恒壓電泳95 V，室溫1 h，4℃封閉過夜，按0.1 ml·cm－2膜面積加入1∶2 000稀釋的一抗 （兔抗 Caspase－3，購自 Cell Signaling公司）雜交2 h，封閉液漂洗后按0.1 ml·cm－2膜面積加入1∶2 000稀釋的二抗 （鼠抗兔IgG抗體，購自北京中山金橋生物有限公司），室溫下搖床雜交1 h，漂洗后加顯色劑 （NBT，購自沈陽基因公司）5 min，放射顯影。

1.8 統計學分析 數據采用SPSS 13.0軟件完成統計處理分析。所有計量資料結果采用表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD－t檢驗。以P≤0.05為差異具有顯著性，P≤0.01為差異具有非常顯著性。

2 結果

2.1 各組細胞培養液中LDH活性測定 見表1。

表1 細胞培養液中LDH活性測定（）

表1 細胞培養液中LDH活性測定（）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與損傷組比較，△P＜0.01

組別 LDH（U／L）80.7±9.8 H／R組 176.9±15.5＊CRK低劑量組 144.7±7.0△CRK中劑量組 109.8±16.4△CRK高劑量組 90.3±5.4正常對照組△

H／R組培養液中LDH活性較正常對照組明顯升高。CRK各濃度組培養液中LDH活性較H／R組低，CRK低、中、高劑量組LDH細胞漏出較H／R組分別降低33.47%、69.75%和90.02%，以高劑量組最為明顯。

2.2 各組心肌細胞凋亡率 見表2，圖1。

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與損傷組比較，△P＜0.01

2.3 各組心肌細胞caspase－3活性蛋白表達水平見表3，圖2。

表3 各組心肌細胞caspase－3活性蛋白表達水平的比較（）

表3 各組心肌細胞caspase－3活性蛋白表達水平的比較（）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與損傷組比較，△P＜0.01

0.71±0.07 H／R組 1.61±0.08＊CRK低劑量組 1.23±0.06△CRK中劑量組 0.97±0.08△CRK高劑量組 0.77±0.05組別 蛋白灰度比值正常對照組△

經 Western blot分析顯示，正常對照組培養乳鼠心肌細胞Caspase－3 17 k D亞單位的表達量很小，灰度值為0.71±0.07；經 H／R處理的組別出現17 k D帶譜，表達量明顯高于正常對照組（P＜0.01）；而CRK組的Caspase－3 17 k D亞單位表達量低于H／R組（P＜0.01）。

圖1 各組心肌細胞凋亡率比較

圖2 各組心肌細胞caspase－3活性蛋白表達水平的比較

3 討論

心肌缺血再灌注損傷主要是由于心肌細胞缺血缺氧，活性氧生成增多，破壞了機體氧化－還原動態平衡。而心肌細胞凋亡是持續性心肌缺血中早期心肌細胞死亡的主要形式，再灌注促進了細胞的不可逆損傷［4］。

細胞凋亡早期改變主要表現為磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，通過PS特異的Annexin V，聯合細胞活性鑒定染料PI雙染，對細胞生存狀態進行定性和定量分析；同時心肌細胞培養液中LDH的活性是觀察H／R損傷的重要指標，反映損傷對細胞膜通透性的影響［5］。將兩項指標結合起來，對細胞膜完整性及穩定性進行研究。本研究利用95%N2＋5%CO2條件使心肌細胞缺氧培養2 h，再復氧，結果顯示培養基中LDH漏出明顯，細胞凋亡率及凋亡蛋白表達增加，證實H／R模型制備成功。而經CRK預處理的心肌細胞，則可不同程度地降低以上損害。說明CRK可以維持心肌細胞膜的完整性及穩定性，從而減輕心肌細胞損傷。

CRK是傳統的ATP敏感性鉀通道開放劑，臨床用于高血壓和心肌缺血的治療［6］。已有研究顯示，線粒體ATP敏感性鉀通道（Mito－KATP）開放后可以顯著降低氧應激誘發的心肌細胞凋亡的發生率［7］。可能為缺血再灌注早期大量氧自由基產生，開放 Mito－KATP，穩定線粒體跨膜電位（Δψm），減少線粒體內膜的通透性轉換孔（MPTP）開放及細胞凋亡的蛋白質釋放，從而減少心肌細胞的凋亡［8－10］。這與本研究得出的結論一致。標志性凋亡蛋白酶caspase－3在細胞即將發生凋亡時會由無活性酶原狀態裂解成由17k D和12 k D兩個亞單位組成的異源二聚體，通過級聯反應最終引起細胞凋亡［11］。本研究結果顯示：體外原代培養的乳鼠心肌細胞經H／R處理后，caspase－3蛋白活性表達上調，而CRK預處理的心肌細胞，可逆轉如上變化，提示CRK對心肌細胞具有保護作用，可以減少caspase－3酶原活化，對心肌細胞凋亡具有抑制作用。綜上，CRK對缺氧復氧致培養大鼠乳鼠心肌細胞的損傷具有保護作用，其機制可能與CRK維持細胞膜完整性與穩定性，下調caspase－3活性蛋白表達水平，降低心肌細胞凋亡有關。

［1］賈三慶，胡大一，常英姿等.ATP敏感性鉀通道開放劑Cromakalim 心 臟保護機制的初步探討［J］.中國醫科導刊，2000，2（5）：40.

［2］Liu Y，Ren G，O，Rourke B，et al.Pharmacological comparison of native mitoc－hondrial K（ATP）channels with molecularly defined surface K（ATP）channels［J］.Mol Pharmacol，2001，59（2）：225.

［3］楊 慧，張珍祥，徐永健.克羅卡林對缺氧性肺動脈高壓的影響及其機制探討［J］.中華結核和呼吸雜志，2003，2（1）：60.

［4］Hoffman JW Jr，Gilbert TB，Poston RS，et al.Myocardial reperfusion injury：etiology，mechanisms，and therapies［J］.J Extra Corpor Technol，2004，36（4）：391.

［5］王曉明，張衛衛，龔衛琴等.氯離子通道阻滯劑DIDS和NPPB對缺血再灌注誘導心肌細胞凋亡保護作用的研究［J］.中華老年心腦血管病雜志，2008，10（10）：765.

［6］Cecchetti V，Tabarrini O，Sabatini S.From cromakalim to different structural classes of K（ATP）channel openers［J］.Curr Top Med Chem，2006，6（10）：1049.

［7］Andreadou I，Iliodromitis EK，Farmakis D，et al.To prevent，protect and save the ischemic heart：antioxidants revisited［J］.Expert Opin Ther Targets，2009，13（8）：945.

［8］Kowalczyk JE，Zablocka B.Protein kinases in mitochondria［J］.Postepy Biochem，2008，54（2）：209.

［9］Light PE，Kanji HD，Fox JE，et al.Distinct myoprotective roles of cardiac sarcolemmal and mitochondrial KATP channels during metabolic inhibition and recovery［J］.FASEB J，2001，15（14）：2586.

［10］Grover GJ.Pharmacology of ATP－sensitive potassium channel（KATP）openers in models of myocardial ischemia and reperfusion［J］.Can J Physiol Pharmacol，1997，75（4）：309.

［11］Faubel S，Edelstein CL.Caspases as drug targets in ischemic organ injury［J］.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord，2005，5（3）：269.