高肺血流致肺動脈高壓幼豬模型中血清內皮素水平的變化

呂 民，符邵鵬，張秀和

（吉林大學中日聯誼醫院 心 外科，吉林 長 春130033）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）的致病機理至今尚未完全闡明，先天性心臟病伴肺動脈高壓的產生，預示著預后不良。近年來發現，體液因子在PH的發病中有重要作用。近年研究認為內皮素（endothlin，ET）與PH的發生有關。但以往的報道意見不一。本實驗以高肺血流致肺動脈高壓幼豬模型，觀察其血漿內皮素1（ET－1）相應變化，國內罕有報道。為進一步闡明肺動脈高壓的發生機理以及尋求新的治療方法提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雜種幼豬，年齡2－3月齡，體重10－12 kg，雌雄不拘，采用隨機數字表方法分2組：組①為高肺血流組（shunt group，n＝12），全部行左側開胸，降主動脈與左肺動脈搭橋術。組②為正常對照組（control group，n＝12）：即假手術組，只開胸無手術處理。兩組一般情況比較差異無顯著性。術后所有動物正常飼養3個月，全部存活，體重增至20－27.5 kg。主要儀器及試劑：多功能麻醉機（Blease英國）、血氣分析儀（i－STATI美國）、監護儀（S／5麻醉監護儀 芬蘭）、動脈測壓（BIOTRANS美國）、光學顯微鏡（日本）、血清內皮素1（ET－1）試劑盒（美國）。其余實驗試劑及設備由吉林大學中日聯誼醫院中心實驗室提供。

1.2 方法

實驗豬術前12小時禁食。肌注氯胺酮20 mg／kg，后建立腿部靜脈通路，靜脈注射戊巴比妥5 mg／kg，插入氣管插管，連接麻醉機，行輔助呼吸。芬太尼20μg／kg、潘可羅寧0.1 mg／kg靜脈注射維持麻醉，呼吸機控制呼吸。經股動脈穿刺置管連接壓力換能器，術中監測有創動脈血壓和心率，監測血氣分析（p H 值、Pa02、PaC02、血離子），鼻溫及肛溫監測。組①行左側開胸，采用人工血管（直徑1 cm）降主動脈與左肺動脈搭橋術。組②為對照組，麻醉、氣管插管呼吸機控制呼吸，只開胸無手術處理。全組術后90 d分別進行如上麻醉操作，仰臥位，固定四肢及頭部，然后正中開胸，檢測肺動脈收縮壓（PASP）、肺血管阻力，肺組織學觀察，Elisa檢測血清內皮素水平。血清樣本提取。血流動力學測量及血清樣本提取完畢，實驗豬肝素化（3 mg／kg）后，放血處死。完整取出心、肺，行病理學檢測。

血清內皮素檢測：全血標本請于室溫放置2小時后于1 000xg離心20分鐘，取上清標本放于－20℃，待檢測。用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗ET－1抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗ET－1抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ET－1呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5軟件包進行統計分析，實驗數據以均數±標準差表示，統計學處理用組間t檢驗，百分率用χ2檢驗。

2 結果

2.1 肺動脈收縮壓（PASP）、肺血管阻力（PVR）變化 術后90天與基礎值相比，PVR：shunt group組由3.89±0.30Wood＇s U 升至10.36±1.83 wood＇s U，出現統計學差異。Control group無統計學差異；PASP：shunt group組由1.50±0.21 kpa升至2.60±0.23 kpa，出現統計學差異。Control group無統計學差異。見表1。

2.2 形態學改變 顯微鏡下觀察：HE染色顯示：對照組左肺動脈內皮及平滑肌細胞排列規則（圖1）；分流組左肺動脈，內膜增厚，平滑肌增生，肌性動脈（MA）數量增多，非肌性動脈NMA數量減少，其中部分血管床毀損（圖1）。

表1 2組動物肺血流動力學變化參數值

2.3 血清內皮素－1檢測結果 術后90天與基礎值相比，ET－1：shunt group組由69.43±12.55 pg／ml升至107.77±20.21 pg／ml，出現統計學差異。C－group無統計學差異。

3 討論

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是在病理學上以肺動脈壓力異常升高和肺血管床進行性閉塞為主要特征的一類疾病。其發生、發展的機理尚未完全闡明。

圖1 2組動物左肺動脈內皮及平滑肌細胞改變

內皮素（Endothelin，ET）是日本學者Yanagisawa等［1］從培養的豬主動脈內皮細胞中分離純化出一種由21個氨基酸殘基組成的話性多肽，內皮素是迄今所知最強的縮血管物質，其作用時間持久。內皮素（endothelin，ET）不僅存在于血管內皮，也廣泛存在于各種組織和細胞中，是調節心血管功能的重要因子，對維持基礎血管張力與心血管系統穩態起重要作用。

盡管PAH的發病機制還不十分清楚，但是肺血管內皮素（endothelin，ET）系統功能損傷對于PAH進程具有重要的作用。對于心血管起主要作用的是ET－1。內皮細胞受到刺激合成并釋放ET－1，刺激ET－1合成的因素包括：組織缺氧，氧化代謝增強及兒茶酚胺水平增高均可刺激前內皮素原的轉錄腎上腺素、血栓素、血管加壓素、血管緊張素、胰島素、細胞因子以及血管壁剪切力與壓力的變化及缺氧等物理化因素。抑制ET－1合成的因素有：NO，PGI2，心房利鈉肽及肝素等。研究發現，缺氧可引起EC的超微結構明顯變化，管壁增生隆起，內膜增厚，胞飲現象明顯增強［2］。缺氧還可以導致EC合成和分泌ET明顯增加［3］。ET通過和受體ETBR結合刺激內皮細胞遷移增殖進入周圍組織，另一方面通過作用于血管平滑肌上ETAR受體而刺激血管內皮生長因子合成，參與血管生成［4］。肺部是ET－1作用和代謝的最重要的器官。ET－1水平升高可能由于以下原因：（1）在肺組織中合成增加：在生理情況下肺泡上皮細胞、肺血管內皮細胞和肺神經內分泌細胞均可以表達ET－1，過度表達的ET－1主要分布在叢樣病變部位（原發性PAH的肺血管常見病理學改變）。（2）肺清除ET－1的能力下降：肺是ET－1代謝的重要器官，正常狀態下主動脈血ET－1水平高于肺動脈血，原發性PAH時肺動脈血ET－1水平高于主動脈血，由此推測肺清除ET－1能力下降。

在PAH的機體內，血漿ET－1水平顯著升高，PAH越高，血漿ET－1水平亦升高，從而認為肺循環ET－1水平升高在PAH的進程中發揮了重要的作用［5］。血管內皮素受體拮抗劑（ETAs）可以提高PAH 的運動耐力［6］。

本實驗表明，體肺動脈分流術后90 d的檢測結果顯示左肺動脈主干擴張，末梢狹窄，鏡下見肺小動脈內膜和中膜平滑肌細胞過度增生，中膜及內膜顯著增厚，其中部分血管腔完全閉塞，出現血管叢樣改變。右肺動脈壓力雖有升高，不及左肺動脈明顯，其肺小動脈中膜僅出現輕度增生，內膜改變不明顯，血管壁無明顯增厚。

本實驗表明，高肺血流肺動脈高壓幼豬模型中，術后90天與基礎值相比，肺動脈收縮壓、肺血管阻力明顯升高，出現統計學差異。血清內皮素－1明顯升高，出現統計學差異；而對照組上述指標無差異。可以證明，先天性心臟病肺動脈高壓時，肺血流動力學及組織學變化與血清內皮素－1變化呈正相關性。本實驗證明，實驗豬的心血管解剖及生理特點與人類極為相似。此動物模型的建立，為今后對人類先天性心臟病肺動脈高壓的形成機理及治療的研究提供了良好的實驗基礎。

［1］Yanagisawa M，Kurihara H，Kimuras，et al.A novel potent vaso constrictor peptide procuced by vascular endothelinal cells［J］.Natrure，1988，332：411.

［2］常小榮.血管內皮細胞與心血管疾病［J］.中國康復，2004，19（2）：122.

［3］Clete A，Kushida，Michael R，et al.Practice parameter for the indications for polysomnography and related procedure：An update for 2005［J］.Sleep，2005，28（4）：489.

［4］王忠學，洪小蘇.內皮素－1與血管生成的研究［J］.醫學綜述，2004，10（7）：398.

［5］盧英民，毛煥元，曹林生.血漿內皮素和內皮衍生舒張因子與先天性心臟病肺動脈高壓關系的研究［J］.臨床心血管病雜志，2003，19（2）：93.

［6］Mc Laughlin W，Archer SL，Badesch DB，et al.ACCF／AHA 2009 expert consensus document on pulmonary hypertension：a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on Expert Consensus Documents and the American Heart Association：developed in collaboration with the American College of Chest Physicians，American Thoracic Society，Inc.，and the Pulmonary Hypertension Association［J］.Circulation，2009，119（16）：2250.