DPC4基因轉染對結腸癌SW480細胞的影響

謝忠士，譚 巖，宋 燕

（1.吉林大學中日聯誼醫院 結 直腸肛門外科，吉林 長 春130033；2.吉林省人民醫院 醫 學診治實驗中心，吉林 長 春130021）

大腸癌是一種常見的嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，在我國的各類惡性腫瘤中，大腸癌的發病率及死亡率居第四位。大腸癌的發生發展是多個基因事件共同作用的結果，其中既有癌基因的激活，也有抑癌基因的失活。在腸道腫瘤的發生、發展中，最重要的基因事件之一是人類染色體18q2的基因改變，18q2是腸道腫瘤中基因改變最頻繁的區域，在這一部位已發現多個與大腸癌密切相關的抑癌基因，譬如 DCC（deleted in colorectal cancer），APC（adenomatous polyposis coli gene）等，而DPC4（deleted in pancreatic carcinoma，locus4）基因是位于人類染色體18q21.1發現的基因。作者通過DPC4／Smad4逆轉錄病毒p LXSN載體的構建，DPC4基因轉染結腸癌細胞，MTT實驗均提示結腸癌細胞SW480的生長受到明顯抑制，初步探討DPC4基因抑制腫瘤細胞生長的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 細胞：SW480細胞由吉林大學公共衛生學院所惠贈。載體：重組p LXSN／DPC4載體的構建吉林大學公共衛生學院，構建好的重組體經多種酶切鑒定分析和PCR鑒定，結果證實成功構建了重組p LXSN－DPC4逆轉錄病毒載體。主要試劑及儀器：TRIZOL Reagent：GIBCO公司產品。胰蛋白酶：Difco公司產品。超級小牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所。ABC試劑盒為美國Vector laboratory公司產品。瓊脂糖：GIBCO公司；DMEM／F12：GIBCO公司；G418：GIBCO公司；Polybrene：Sigma公司；SDS、DEPC：Sigma公司；丙烯酰胺／甲叉丙烯酰胺：Sigma公司；胰蛋白酶：Difco公司；逆轉錄酶、TRIzo L、DMEM購自GIBCO公司；青霉素及鏈霉素：TAKARA公司；MTT：Sigma公司；Superscript TM逆轉錄試劑盒：GIBCO公司；脂質體Lipofectamine TM2000、DNA Ladder：美國Invitrogen公司；PCR擴增儀（Gene Amp，美國）；超凈工作臺（YZ－875蘇州凈化設備廠）；自動高壓蒸氣消毒器（SONY，日本）；低溫冰箱（－80℃SANYO，日本）；恒溫水浴箱（江蘇常州國華儀器廠）；高速低溫離心機（TOMY GRX－220，日本）。

1.2 方法 選擇無DPC4表達的人結腸癌細胞系SW480為實驗細胞，構建表達野生型DPC4基因的逆轉錄病毒p LXSN載體，轉染結腸癌SW480細胞株，經G418篩選，獲取穩定表達DPC4基因的子代SW480結腸癌細胞，以空載體p LXSN為陽性對照，分別命名為 SW480／DPC4、SW480／p LXSN 細胞；取母代SW480細胞為陰性對照，命名為SW480／－細胞。并經Western鑒定。運用MTT方法檢測體外結腸癌細胞的生長情況的改變。

1.3 結果判斷 Western顯示在SW480／DPC4細胞中可見一大小約為60 KDa的DPC4蛋白條帶。MTT體外檢測癌細胞的生長情況。

1.4 數據處理 應用SPSS17.0統計軟件進行處理。

2 結果

2.1 Western對DPC4蛋白的鑒定 Western顯示在SW480／DPC4細胞中可見一大小約為60 KDa的DPC4蛋白條帶；而在陽性對照SW480／p LXSN和陰性對照SW480／－細胞株，均未見該蛋白條帶（見圖1）。提示在SW480／DPC4細胞中已有DPC4蛋白的翻譯。至此可以證實，本實驗已成功將DPC4基因轉移至結腸癌細胞SW480細胞中，成功獲取了SW480／DPC4子代細胞株。

圖1 Westen對SW480細胞中DPC4蛋白表達的測定

2.2 MTT體外檢測癌細胞的生長情況

本實驗 分別比較 了 SW480／DPC4、SW480／p LXSN、SW480／－細胞體外生長曲線（見圖2），發現SW480／DPC4細胞較 SW480／p LXSN、SW480／－細胞，生長明顯減緩，經統計有顯著差異（P＜0.05）。培養第7天的時候，抑制率達50%左右。

3 討論

圖2 細胞生長曲線

在我國結腸癌的發病率逐年上升，經過多年的研究發現其與多種基因的突變有關，如p53，p16，DCC，C－myc等。在結腸癌中DPC4基因的突變率各家的報道不一，這可能和各家的樣本量小以及各病例的病變程度不一有關。據報道，在幼年性息肉病變中發現有Smad4的胚系突變，在大腸癌中，Smad4突變主要包括移碼突變、框內缺失、無義及錯義突變。突變熱點主要位于羧基端區域，往往使得Smad4負責形成純聚體和雜聚體的蛋白區域發生突變，因而影響到Smad4的信號傳導功能。Smad4的突變頻率隨著大腸癌的進展逐漸增高，表明其與大腸癌的演進及遠處轉移有關。MacGrogan［1］檢測了9例結腸癌，發現有5例DPC4基因突變，突變率為54，其中有兩例是在外顯子1和8的錯義突變，有兩例是部分的純合子缺失。Michiko［2］分析了176例處于不同病變階段的結腸腫瘤，Smad4的突變包括了7例移碼突變、4例無義突變及9例錯義突變和I例缺失突變。Smad4的突變率在腺瘤是0%（0／40），在粘膜內癌是10%（4／39），在不伴轉移的早期浸潤癌中是7%（3／44），而在遠處轉移癌中是31%（11／36）。在伴Smad4的浸潤、轉移性腫瘤中同時伴有其他等位基因的缺失。因而他認為DPC4作為抑癌基因，它的失活不僅誘導了腫瘤的發生，而且還促進了腫瘤的發展。Ohtaki N等［3］認為Dpc4基因改變可能在結直腸癌的腫瘤形成和肝轉移過程中起到一定的作用。Taketo MM等［4］在Smad4突變鼠的研究中也認為Smad4突變在結直腸腫瘤的惡變過程中起了重要的作用。Maitra等［5］在用免疫組化檢測83例結直腸腫瘤組織，包括19例腺瘤，64例腺癌（其中一期11例，二期13例，三期17例，四期23例）。結果顯示腺瘤及一期腺癌無DPC4蛋白缺失，而二期腺癌的缺失率為8%（1／13），三期腺癌的缺失率為6%（1／17），四期腺癌的缺失率為22%（5／23），因而認為Dpc4基因的失活在結直腸癌的發病機制中可能是晚期事件。

本實驗觀察到，DPC4基因成功轉染入SW480細胞，在體外可以抑制結腸癌細胞SW480生長，MTT顯示體外生長明顯受到抑制，7天以后抑制率可以達到50%左右。這可以說明DPC4基因在結腸癌細胞中重獲表達，可以抑制癌細胞的生長，降低侵襲能力和惡性程度。其中的機理可能還是與TGF－β信號通路的恢復有密切的關系，但具體機制需進一步實驗證實。

［1］Macgrogan，D，Pegram M，Slamon D，et al.Comparative Mutational Analysis ofin Prostatic and Colorectal carcinomas［J］.Oncogene，1997，15（9）：1111.

［2］Michiko M，1i jima T，Konishi M，et al.Higher frequency of Smad4 gene mutation human colorectal cancer with distant metastasis［J］.Oncogene，1999，18（20）：3098.

［3］Ohtaki N，Yamaguchi A，Goi T，et al.Somatic alterations of the DPC4 and Made2genes in colorectal cancers and relationship to metastasis［J］.Int J Oncol，2005，18（2）：265.

［4］Taketo MM，Takaku K.Gastrointestinal tumorigenesis in Smad4（Dpc4）mutantmice［J］.Department of Pharmacology，2004，13，（3）：85.

［5］Maitra A，Molberg K，Albores－Savedra J，et al.Loss of DPC4expression in colonic adenocarcinomas correlates with the presence of metastatic disease［J］.Am Pat Hol，2007，157（4）：1105.

［6］Ke Z，Zhang X，M a L，et al Deleted in pancreatic carcin0ma locus4／Smad4 participates in the regulation of apoptos by affecting the Bcl－2／Bax banlance in non－small cell lung cancer［J］.Hum Pathol 2008，39（10）：1438.