SIK2抑制3T3－L1脂肪細胞脂肪合成的效應及機制

杜 靜，楊 超，晏耀明，陸 紅，周 薇，鄒德學

（1.北京大學深圳醫院，廣東 深圳518036；2.暨南大學第二臨床醫學院，廣東 深圳518020）

肥胖已成為現代生活的流行病和21世紀影響人類健康的主要危險因素之一，深入了解機體甘油三酯合成和動員的調控機制，有助于發現治療肥胖的新方法。有研究表明一種脂肪特異性AMPK相關蛋白激酶－SIK2，在脂肪細胞的能量代謝中發揮著重要的調節作用［1］。本試驗通過前期構建好的SIK2腺病毒表達載體，研究SIK2基因高表達影響3T3－L1成熟脂肪細胞能量代謝的作用及其機制，深入認識脂代謝異常的發病機理，為發現治療肥胖新的分子靶標提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3－L1細胞系購自 ATCC公司。SIK2腺病毒表達載體由我室構建和鑒定［2］，胰蛋白酶購自GIBCO公司。M－MLV逆轉錄酶（molony murine leukemia virus reverse transcriptase）購自Promega公司。DMEM和胎牛血清購自GIBCO公司。SIK2、ACC2、FAS、SCD1、GPAT、DGAT1、SREBP1和三磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde－3－Phosphate Dehydrogenase ，GAPDH）。PCR 引物由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 3T3－L1前脂肪細胞的誘導分化：3T3－L1細胞按常規的貼壁細胞方法培養。在細胞狀態良好時，傳代分瓶（1×105／ml），細胞接觸抑制兩天后加入含10%胎牛血清的DMEM培養液（含0.5 m M 3－異丁基－1甲基黃呤、10μg／ml胰島素、0.25μM地塞米松）培養兩天，換成含10%胎牛血清的DMEM培養液（含10μg／ml胰島素）培養兩天，最后改為含10%胎牛血清的DMEM培養，每兩天換液，直至90%的細胞為成熟的脂肪細胞。

1.2.2 SIK2腺病毒載體轉染成熟的3T3－L1：脂肪細胞用2.5×1011純化病毒顆粒／ml SIK2腺病毒和空載體病毒轉染成熟3T3－L1脂肪細胞，并以空載體病毒作為陰性對照，更換培養液后在37℃細胞培養箱中繼續培養48小時后，收集細胞，提取細胞總RNA。

1.2.3 油紅O染色：各組3T3－L1前脂肪細胞傳代于放置無菌玻片的6孔板中，細胞按上述誘導分化方案進行誘導，分別于轉染的48小時后對細胞進行油紅O染色。按Ramirez等報道的油紅O染色提取法提取結合到脂滴的油紅O染料［3］，即0.5%油紅O貯存液（溶于異丙醇）用水按3∶2稀釋。棄去培養孔中的培養基，PBS沖洗3次；用3.7%中性福爾馬林固定5 min，PBS洗滌3次；固定后的細胞用上述油紅O稀釋液室溫孵育1 h后，移去染液，蒸餾水漂洗細胞3次倒置顯微鏡下觀察。用水徹底沖洗后干燥，入異丙醇提取結合到脂滴的染料，在510 nm波長處比色，記錄吸光度。

1.2.4 實時RT－PCR檢測脂肪細胞中SIK2和脂代謝相關酶及轉錄因子SREBP1的表達：收集轉染后48小時的成熟脂肪細胞，提取細胞總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，并用紫外分光光度計測定RNA濃度。實時RT－PCR按SYBR Prime－Script RT－PCR kit的操作說明進行，擴增采用ABI PRISM 7900 Sequence Detectort（美國ABI公司）熒光定量PCR儀，測定SIK2和脂代謝相關酶及轉錄因子SREBP1 m RNA表達，結果以目標基因與GAPDH基因表達的比值表示，相應引物的序列見表1。

1.2.5 統計分析：用SPSS 11.0軟件進行統計分析。所有計量資料采用均數±標準差（X±SD）來表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為顯著統計學差異。

2 結果

2.1 SIK2基因高表達對3T3－L1脂肪細胞脂滴形成的影響 顯微鏡下觀察，未分化脂肪細胞為梭型或三角形，類似于成纖維細胞，經過誘導，細胞分化充脂，隨時間延長逐漸聚集為大脂滴。腺病毒載體轉染脂肪細胞，用油紅O染色提取法測定波長510 nm處結合于脂滴的油紅O染料的吸光度，以平均值±SD表示。由圖1可見，轉染48小時后，與對照組比較，SIK2基因高表達組細胞漿中脂滴數量和體積均明顯減少，脂肪細胞內油紅O染料的吸光度下降56%，由0.63降低到0.28（P＜0.05）。

表1 單鏈oligo引物設計

2.2 SIK2基因高表達對脂肪細胞生脂基因及轉錄因子表達的影響 實時熒光RT－PCR定量測定脂肪細胞SIK2和脂肪合成有關基因mRNA水平，結果以目標基因與GAPDH基因表達的比值表示，見圖2。結果顯示SIK2腺病毒載體轉染組SIK2 mR NA水平與空載體轉染的對照組脂肪細胞比較，表達量明顯增加，達到273倍（圖A），證實脂肪細胞高效表達腺病毒載體轉染的SIK2基因。在SIK2基因轉染組，脂肪細胞脂合成代謝相關基因ACC2、FAS、SCD1、GPAT、DGAT1的 mRNA水平與對照組相比分別下降了31%、61%、57%、60%、52%，轉錄因子SREBP1 mRNA的表達水平減少了28%（P＜0.05）（圖B）。

圖1 SIK2基因高表達對脂肪細胞脂肪合成的作用影響

圖2 SIK2基因高表達影響脂肪細胞脂代謝有關基因的表達

3 討論

肥胖的主要原因是機體能量代謝失衡，熱量攝入大于消耗而導致機體脂肪的過量沉積。控制肥胖，減少體脂聚集可降低心血管疾病的危險性和發病率。SIK2是新發現的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）族系的一個成員，SIK2蛋白分子較特異地表達于脂肪組織中。有研究表明SIK2是調節機體脂質代謝過程中的一個重要能量調控蛋白［1］，但具體機制尚不清楚。

利用我們構建高效表達SIK2的重組小鼠腺病毒載體［2］，通 過 R－T PCR 和 Western Blot證 實3T3－L1脂肪細胞高效表達SIK2 m RNA和蛋白，但SIK2對脂肪細胞功能的影響尚不十分清楚。3T3－L1未分化脂肪細胞是從小鼠Swiss 3T3纖維母細胞克隆出來的，在誘導劑（insulin、IBMX和DEX）作用下，分化為成熟的脂肪細胞［4］，通過基因轉移技術，用小鼠SIK2重組腺病毒載體轉染3T3－L1成熟脂肪細胞獲得穩定表達SIK2基因的脂肪細胞株，觀察SIK2基因高表達對脂肪細胞脂肪合成的影響。

在脂肪酸生物合成中，ACC、FAS、SCD－1是脂肪酸合成限速酶。ACC催化脂肪酸合成的第一步反應，即乙酰Co A羧化為脂肪酸合成必需的底物丙二酰Co A（MA），然后MA在脂肪酸碳鏈延長酶系作用下進一步合成長鏈脂肪酸。最近研究表明，ACC受磷酸化、去磷酸化的調節，AMPK是調節ACC活性的主要物質，使ACC磷酸化和抑制ACC的作用［3］。FAS是脂肪酸合成最后環節的限速酶，催化MA和乙酰Co A合成棕櫚酸，調控細胞內內源性脂肪酸的合成。FAS的表達主要在轉錄水平被調控，動物體脂水平與FAS的表達呈正相關［6］。SCD－1是催化單不飽和脂肪酸合成的限速酶，GPAT和DGAT分別是催化甘油－3－磷酸酯合成甘油三酯的初始和最后步驟的關鍵調節酶。我們的實驗結果顯示，SIK2高表達顯著降低3T3－L1脂肪細胞內脂肪含量，提示SIK2可抑制3T3－L1細胞的脂肪合成功能，其作用與下調脂肪細胞內脂肪酸合成關鍵酶 ACC、FAS、SCD－1、GPAT 和 DGAT1 mRNA的表達有關。該結果說明了SIK2作為AMPK家族中的成員，起到了AMPK樣的降低ACC活性的作用，同Saha AK報道的一致［5］。

轉錄因子SREBPs是一類能與膽固醇調節組件1（SRE－1）發生特異性結合的蛋白，包括兩種異構體SREBP－1和SREBP－2。SREBP－1可調控脂肪酸和甘油三酯的合成，SREBP－2主要調控膽固醇代謝。SREBP－1在脂肪酸合成中所調控的靶基因有：ACC、FAS、SCD、GPAT 等［7］，其中 FAS基因是脂肪酸合成中的關鍵酶。Kakuma等的研究發現SREBP－1c的過度表達可引起FAS基因轉錄增加，從而導致FAS活性的增強，并引起脂肪酸合成增多和TG增加，在肝臟等非脂肪組織異常沉積形成脂肪肝［8］。我們的實驗發現 SIK2轉染組 SREBP－1 m RNA的表達水平相應地降低，提示SIK2抑制脂肪合成代謝的作用與SREBP－1信號傳導通路有關，SIK2可能通過降低SREBP－1水平來調節ACC、FAS、SCD、GPAT、DGAT等脂肪合成基因的表達，減少細胞內脂肪含量。

綜合所述，本研究從基因水平探討了SIK2對脂肪細胞能量代謝的影響和機制，其在蛋白水平的作用有待進一步證實。深入研究SIK2這一新的脂代謝調節因子將為探索肥胖病基因治療的新途徑提供理論依據，為尋找新的防治肥胖的藥物作用靶點提供基礎資料。

［1］Du J，Chen Q，Takemori H，Xu H.SIK2 Inhibits Expression of Lipogenic Genes in Adipocytes［J］.Obesity，2008，16（3）：531.

［2］杜 靜，周 鈞，楊 超，等.小鼠SIK2重組腺病毒載體在3T3－L1脂肪細胞中的表達［J］.中國實驗診斷學雜志，2008，12（11）：1355.

［3］Ramirez ZJL，Castro MF，Kuri HW.Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracyctoplasmic lipids with Oil red O［J］.Histochemistry，1992，97：493.

［4］Joost HG，Schurmann A.Subcellular fractionation of adipocytes and 3T3－L1 cells［J］.MethodsMol Biol，2001，155（1）：77.

［5］Saha AK，Ruderman NB.Malonyl－CoA and AMP－activated protein kinase：an expanding partnership［J］.Mol Cell Biochem，2003，253（1－2）：65.

［6］Semenkovich C F.Regulation of fatty acid synthase［J］.Progress in Lipid Research，1997，36：43.

［7］Sekiya M，Yahagi N，Matsuzaka T.et al.SREBP－1－independent regulation of lipogenic gene expression in adipacytes［J］.J Lipid Res，2007，48（7）：1581.

［8］Kakuma T，Lee Y，Higa M，et al.Leptin，troglitazone and the expression of sterol regulatory element binding proteins in liver and pancreatic islets［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（15）：8536.