新多胺類似物四丁基丙二胺對人肝癌Hep G2細(xì)胞增殖及侵襲遷移的影響

楊建林，韓 鈺，王 凱，張賀吉，張 軍，王艷林＊

（1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 分 子生物學(xué)研究所；湖北 宜 昌443002；2.武漢工程大學(xué)，湖北省新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武 漢430073）

肝癌是常見的惡性腫瘤，5年自然死亡率超過95%。全球每年有超過50萬人患有肝癌，其中一半以上在中國。肝癌治療是醫(yī)藥領(lǐng)域需予面對的強(qiáng)力挑戰(zhàn)。現(xiàn)今肝癌治療仍以手術(shù)切除為主，然而從臨床實(shí)踐來看，包括進(jìn)行術(shù)前化、放療后能夠施行完全肝癌切除手術(shù)患者比例不到肝癌總例數(shù)的10%。其余90%肝癌患者尚無明顯疾病緩解或延命效果的治療手段。

目前針對抗腫瘤新靶點(diǎn)－多胺代謝途徑而合成的多胺類似物已成為抗腫瘤新藥物研究熱點(diǎn)，學(xué)者已證實(shí)部分多胺類似物顯示出良好的臨床應(yīng)用前景［1，2］，對非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用［3，4］，提示多胺類似物在腫瘤臨床治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究分析了新多胺類似物四丁基丙二胺（tetrabutyl propanediamine，TBP）對人肝癌Hep G2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，并分析了可能的原因，為抗肝癌新藥的研發(fā)提供了新思路和探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 肝癌Hep G2細(xì)胞系購自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心，本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代保存；多胺類似物四丁基丙二胺（tetrabutyl propanediamine，TBP）由武漢工程大學(xué)合成；3－（4，5－二甲基噻唑）－2，5－二甲苯基四氮唑溴鹽（MTT）為美國Sigma公司產(chǎn)品；RPMI－1640培養(yǎng)基和新生牛血清為Gibico公司產(chǎn)品；PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品；ECL試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品；鼠抗人β－action抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；鼠抗人SSAT、SMO單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)制備，羊抗鼠IgG－HRP為Jackson公司產(chǎn)品。基質(zhì)膠Matrigel為美國BD公司產(chǎn)品；Transwell培養(yǎng)板為美國Corning公司產(chǎn)品；全波長酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；Waters 2690高效液相色譜儀為美國Waters公司產(chǎn)品；EPLCS XL流式細(xì)胞分析儀為Becman－Coulter公司產(chǎn)品，Sirius熒光儀為Berthold公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肝癌 Hep G2細(xì)胞在含10%新生牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至對數(shù)生長期時進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。TBP溶于dd H2O，－20℃保存，使用時用RPMI－1640培養(yǎng)液稀釋至需要濃度。

1.2.2 MTT法檢測TBP對腫瘤細(xì)胞生長的影響將Hep G2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入50μl細(xì)胞懸液（含2000個細(xì)胞），培養(yǎng)24 h后分別加入50μl／孔不含TBP的RPMI－1640培養(yǎng)液作為正常細(xì)胞對照孔和含不同濃度TBP的RPMI－1640培養(yǎng)液（TBP終濃度為10～80μmol／L），每個藥物濃度設(shè)4個復(fù)孔，分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加終濃度為5 mg／ml的MTT孵育4 h，棄去上清液，加DMSO 150μl／孔，振蕩混勻后用酶標(biāo)儀測波長570 nm的吸光度值（OD值）。腫瘤細(xì)胞生存率＝（實(shí)驗(yàn)孔 OD值／對照孔 OD值）×100%。

1.2.3 Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期Hep G2細(xì)胞用80μmol／LTBP預(yù)處理48h，然后換為無血清RPMI－1640培養(yǎng)基，饑餓處理4h后消化細(xì)胞，用含0.2%BSA的RPMI－1640培養(yǎng)液懸浮，每個培養(yǎng)小室上室內(nèi)加入200μl細(xì)胞懸液（5×104個細(xì)胞）。培養(yǎng)小室下孔加入800μl含20%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)18 h。將膜用PBS洗2次，多聚甲醛固定30 min，洗2次，加入蘇木精染色，室溫10 min，清水浸泡20 min，用棉簽輕輕擦拭上室內(nèi)側(cè)面的細(xì)胞，同時清水沖洗3－5遍，用鑷子撥下小室的膜，下側(cè)面向上平鋪于載玻片，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察，計(jì)數(shù)每個視野的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。遷移抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞平均數(shù)／對照組穿膜細(xì)胞平均數(shù)）×100%。

1.2.4 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn) Matrigel放置4℃冰箱使其完全融解，取50μL／孔加入Transwell侵襲小室的上室中，將培養(yǎng)板放置37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜，將80μmol／LTBP預(yù)處理48 h的Hep G2細(xì)胞消化，用無血清的RPMI－1640培養(yǎng)液懸浮，每個培養(yǎng)小室上室內(nèi)加入200μl細(xì)胞懸液（1×104個細(xì)胞）。培養(yǎng)小室下室加入500μl含20%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。取出小室，用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，用棉簽小心擦拭去濾膜上的Matrigel膠，PBS洗3次，加入蘇木精室溫染色10 min，清水沖洗3－5遍，清水浸泡20 min，用鑷子撥下小室的膜，下側(cè)面向上平鋪于載玻片，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察，計(jì)數(shù)每個視野的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。遷移抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞平均數(shù)／對照組穿膜細(xì)胞平均數(shù)）×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化 Hep G2細(xì)胞經(jīng)20、40、80μmol／L的 TBP處理48h后，用4℃預(yù)冷的PBS配制的75%乙醇固定過夜，RNA酶37℃消化、碘化丙啶（0.5 mg／m L）避光染色30min，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。

1.2.6 Western blot檢測多胺代謝相關(guān)蛋白表達(dá)

40μmol／L TBP作用HepG2細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，用細(xì) 胞 裂 解 液（20 mmol／L Tris－HCl，p H8.0，150 mmol／L NaCl，0.2%NP40）冰上裂解30 min，離心取上清作為檢測樣品，考馬斯亮藍(lán)染色測定蛋白總含量，加入上樣Buffer沸水中水浴5 min使得蛋白變性，在12%SDS－聚丙烯酰胺凝膠100V電壓下垂直電泳分離蛋白，再將其于60v轉(zhuǎn)印1.5 h到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加鼠抗人SMO、SSAT、ODC、action抗體作用過夜，羊抗鼠IgG－HRP二抗反應(yīng)2 h，TBST洗滌兩遍，ECL顯影壓膠片。

1.2.7 化學(xué)發(fā)光法測定SMO活性 Hep G2在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)致對數(shù)生長期，80μmol／LTBP處理24 h后，經(jīng)PBS緩沖液原位洗滌，用83 mmol／L－1甘氨酸緩沖液（p H8.0）覆蓋細(xì)胞，每孔200μl。置－80℃低溫冰箱冷凍48h后，收集細(xì)胞裂解液備用。SMO活性分析采用化學(xué)發(fā)光法，酶活性單位按相對光強(qiáng)度單位（relative lightuni，t RLU）定義為：RLU·mg－1·min－1。

1.2.8 反相高效液相色譜法測定細(xì)胞內(nèi)多胺含量收集對照和80μmol／LTBP處理48 h的Hep G2細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入1 ml細(xì)胞裂解液（20 mmol／L Tris－HCl，p H 7.5，150 mmol／L NaCl，1%Triton X－100），246.5×g離心后收集上清液備用。取處理好的細(xì)胞裂解液800μl，加入1 mmol／L內(nèi)標(biāo)己二胺（1，6－diaminohexane，DAH）20μl、2 mol／LNaOH 500μl和苯甲酰氯10μl，混勻后于40℃水浴中保溫20 min，用2 ml飽和NaCl溶液終止反應(yīng)，用2 ml乙醚分別提取3次，合并乙醚提取液，空氣干燥，沉淀用1 ml甲醇溶解，微孔濾膜（0.5μm）過濾后經(jīng)Waters 2690檢測，流動相為乙腈－水（38∶62），檢測241.3 nm波長處的吸光度單位（absorb unit，AU）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用x－±s表示，采用單因素方差分析比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TBP有效抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖 不同濃度的TBP作用Hep G2細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，隨著藥物濃度的增高和時間的延長，對Hep G2細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，且呈時間和濃度依賴性，當(dāng)80μmol／LTBP作用72h時，生長抑制率達(dá)38.79%，各時間組與濃度組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，Hep G2細(xì)胞在TBP作用下，無明顯亞凋亡峰出現(xiàn)，而是細(xì)胞周期發(fā)生顯著性改變。低濃度（20μmol／L）藥物處理細(xì)胞后，處于S期的細(xì)胞數(shù)略有減少，分裂期G2期細(xì)胞數(shù)稍有增高；當(dāng)藥物濃度提高到40μmol／L后，大量細(xì)胞被阻滯在DNA合成前的G0／G1期，S期的細(xì)胞數(shù)顯著減少，有效抑制肝癌Hep G2細(xì)胞生長增殖（表2）。

表1 TBP處理對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用（x—±s，n＝3）

表2 TBP對Hep G2細(xì)胞周期的影響（x－±s，n＝3）

2.2 TBP抑制Hep G2細(xì)胞的遷移／侵襲能力 小室遷移／侵 襲 實(shí) 驗(yàn) 顯 示，80μmol／L TBP 處理Hep G2細(xì)胞后，細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜和Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯低于未處理細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示TBP顯著抑制了人肝癌Hep G2細(xì)胞的遷移和侵襲能力。與對照組相比，80μmol／L TBP處理細(xì)胞組遷移細(xì)胞數(shù)下降了82.53%，侵襲細(xì)胞數(shù)減少了89.41%（見表3，圖1）。

圖1 Transwell技術(shù)檢測TBP對HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響×200

表3 TBP對HepG2細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 （x－±s，n＝5）

2.3 TBP對Hep G2細(xì)胞多胺代謝的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，用80μmol／L TBP處理Hep G2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中SMO蛋白表達(dá)量顯著升高（見圖2），但檢測細(xì)胞裂解液中SMO活性發(fā)現(xiàn)，SMO活性被抑制，與對照組相比，差異有顯著性意義（見圖3）。反向高效液相色譜法檢測顯示TBP顯著性增加細(xì)胞內(nèi)腐胺的含量，但對精胺與精脒無明顯影響（見表4）。

1.用80μmol／L TBP處理48 h的HepG2細(xì)胞；2.Hep G2對照細(xì)胞

圖3 TBP對HepG2細(xì)胞內(nèi)SMO蛋白活性的影響（x—±s，n＝3）

表4 TBP對HepG2細(xì)胞內(nèi)多胺含量的的影響 （μg／mg，x—±s，n＝3）

3 討論

多胺是廣泛存在于生物體組織內(nèi)的一類多價(jià)陽離子的小分子化合物，是正常細(xì)胞生長所必須，還與腫瘤的發(fā)生和快速生長密切相關(guān)。多胺代謝途徑已經(jīng)成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)［5，6］。目前已經(jīng)合成一些與天然多胺有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的多胺類似物（polyamine ana－logue）用于抗多種腫瘤的基礎(chǔ)和前期臨床研究［7］。TBP是為一種新合成的腐胺對稱性修飾物，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，TBP能有效抑制膀胱癌和骨髓瘤細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞程序性凋亡（另文發(fā)表）。本研究進(jìn)一步分析了TBP對人肝癌Hep G2細(xì)胞生長的影響，證實(shí)了TBP通過阻滯細(xì)胞在G0／G1期有效抑制HepG2細(xì)胞的生長，抑制效應(yīng)有一定的量效關(guān)系，但不會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。SMO是新近被鑒定的主要參與多胺分解代謝途徑的關(guān)鍵酶，它氧化天然多胺成分之一的精胺，將其轉(zhuǎn)化為精瞇，同時產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的活性氧本研究中TBP處理細(xì)胞后，細(xì)胞中SMO蛋白表達(dá)量增加，但酶活性發(fā)生顯著性降低，同時細(xì)胞中精胺含量未見明顯改變，因此我們推測TBP可能通過某種機(jī)制抑制肝癌Hep G2細(xì)胞SMO活性，從而導(dǎo)致代償性SMO表達(dá)量增高。而TBP抑制細(xì)胞增殖的同時，細(xì)胞中腐胺含量的顯著性增加這一現(xiàn)象與以往研究高腐胺含量促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)果背道而馳，因此我們推斷TBP對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用可能不是我們已知的常見干擾多胺代謝途徑的方式，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤生物學(xué)行為的特征表現(xiàn)，也是腫瘤臨床治療的難題，影響腫瘤患者長期生存的主要因素。據(jù)報(bào)道，60%以上的惡性腫瘤患者于初次診斷時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移，在臨床腫瘤患者中，約有80%－90%以上死于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。因此抑制腫瘤的侵襲、遷移能力也是抗腫瘤治療的一種有效途徑。本研究通過Trans－well的方法檢測了TBP對人肝癌Hep G2細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。結(jié)果顯示TBP能夠有效抑制Hep G2細(xì)胞的侵襲、遷移能力，藥物處理后穿過聚碳酸酯膜和Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，侵襲、遷移抑制率高達(dá)82.53%和89.41%。

綜上所述，TBP能夠有效抑制人肝癌Hep G2細(xì)胞增殖、降低Hep G2細(xì)胞侵襲、遷移能力，其機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成，改變細(xì)胞周期時相分布有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TBP是一種很有潛力的抗肝癌藥物。

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