β－環(huán)糊精輔助提取沙棘總黃酮工藝研究

吳春芝，谷福根，師帥，孟根達來，王毅，張愛武

(1;內蒙古醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑部，內蒙古呼和浩特010050;2;內蒙古醫(yī)學院藥學院，內蒙古呼和浩特010100)

β－環(huán)糊精輔助提取沙棘總黃酮工藝研究

吳春芝1，谷福根1，師帥2，孟根達來1，王毅1，張愛武1

(1;內蒙古醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑部，內蒙古呼和浩特010050;2;內蒙古醫(yī)學院藥學院，內蒙古呼和浩特010100)

目的研究β-環(huán)糊精(β-CD)輔助提取沙棘總黃酮(TFH)的新工藝。方法以β-CD為輔助材料，提取沙棘中沙棘總黃酮，同時測定沙棘總黃酮的提取量、提取率以及浸膏中沙棘總黃酮含量等指標，并與傳統(tǒng)醇提、水提工藝進行比較。結果β-CD輔助提取新工藝的沙棘總黃酮提取量、提取率以及浸膏中沙棘總黃酮含量等指標，與醇提工藝接近，但明顯優(yōu)于水提工藝(P＜0;05)。結論β-CD輔助提取新工藝具有成本低、安全性高、無污染等特點，具有應用前景。

沙棘;總黃酮;β-環(huán)糊精;包合作用;提取工藝;紫外分光光度法

沙棘為胡頹子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L;的干燥成熟果實，蒙古族習用藥材［1］，具有活血散瘀、化痰寬胸、補脾健胃、生津止渴、清熱止瀉之功效［2］。沙棘中含有黃酮類、萜類、甾體類、揮發(fā)油類、糖類和有機酸等多種成分［3］。其中，沙棘總黃酮(TFH)具有抗心肌缺血、抗心律失常、調血脂、抗腫瘤、調節(jié)免疫系統(tǒng)等多種藥理作用［4］，還可直接清除超氧陰離子及羥基自由基，抗衰老作用顯著［5］。目前，沙棘中沙棘總黃酮的提取方法主要有水浸提法、堿水浸提法以及乙醇提取法等［6-8］。前兩種方法，均以水作為溶劑，雖然成本低，但提取率低，產物中水溶性雜質多，故工業(yè)生產中應用很少;乙醇提取法是目前應用最廣的沙棘總黃酮提取工藝，但這種方法需要大量乙醇，且成本高、周期長、安全性差。近年來，國內有學者采用β-環(huán)糊精(β-CD)作為輔助性材料，提取丹參、虎杖和蒙藥廣棗總黃酮(TFC)中有效成分，取得較理想結果［9-11］。鑒于沙棘總黃酮與廣棗總黃酮結構相似，筆者將系統(tǒng)研究β-CD對沙棘中沙棘總黃酮提取的實際影響，旨在得到一種經濟、安全、環(huán)境污染少的沙棘提取新工藝。

1 儀器與試藥

UV-2401 PC型可見-紫外分光光度計(日本島津);T-1000型電子天平(美國雙杰兄弟公司);AB265-S型電子天平(瑞士梅特勒·托利多公司);DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精密實驗設備有限公司)。沙棘購于內蒙古林蒙醫(yī)藥有限公司，產地內蒙古;蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為10080-200707);β-環(huán)糊精(山東新大精細化工有限公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 總黃酮含量測定[1，12]

溶液制備:精密稱取蘆丁對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加30%乙醇適量，超聲使溶解，放冷后再加30%乙醇至刻度，搖勻，即得質量濃度為200 μg/mL的蘆丁對照品溶液。取沙棘粗粉2 g，加60%乙醇40 mL，加熱回流1 h，提取2次，紗布過濾，合并2次濾液，用60%乙醇定容于100 mL量瓶中，過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

測定波長選擇:量取蘆丁對照品溶液2;0 mL，置25 mL量瓶中，加30%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1;0 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁試液1;0 mL，搖勻，放置6 min，再加10%氫氧化鈉試液10 mL，加30%乙醇至刻度，搖勻，放置10 min，以相應試劑作空白，于分光光度計在370～700 nm波長范圍進行掃描，結果測得最大吸收波長為500 nm。

標準曲線制備:精密量取對照品溶液1;0，2;0，3;0，4;0，5;0，6;0 mL，分別置25 mL量瓶中，按測定波長選擇項下同法操作，于500 nm波長處測定各吸光度。以吸光度(A)為縱坐標、質量濃度(C)為橫坐標，得回歸方程A=0;010 7C+0;026，r=0;999 8 (n=6)。結果表明，蘆丁質量濃度在0;2～1;2 mg范圍內與吸光度呈良好線性關系。

加樣回收試驗:精密量取已知質量濃度的沙棘總黃酮供試品溶液9份，每份1;0 mL，置25 mL量瓶中，分別加入不同體積的蘆丁對照品溶液，同法處理后，以其中1份不加氫氧化鈉試液的樣品為空白，于500 nm波長處測定吸光度，計算回收率。結果見表1。

2．2 藥材中沙棘總黃酮含量的測定

按照2010年版《中國藥典(一部)》沙棘項下規(guī)定，依法測定。取沙棘粗粉2 g，精密稱定，加60%乙醇30 mL，加熱回流2 h，放冷，濾過，殘渣再分別加60%乙醇25 mL，加熱回流2次，每次1 h，濾過。合并濾液，置100 mL量瓶中，殘渣用60%乙醇洗滌，洗液并入同一量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取提取液25 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試液1;0 mL，置25 mL量瓶中，同法處理后，以1份不加氫氧化鈉試液的樣品為空白，于500 nm波長處測定吸光度，結果沙棘藥材中沙棘總黃酮的含量為(49;8±2;6)mg/g，n=3，符合藥典有關規(guī)定。

表1 加樣回收試驗結果(n=9)

2．3 β－CD對沙棘總黃酮提取量的影響

取沙棘粗粉9份，每份5 g，分別加入β-CD 0，0;25，0;5，1;0，1;5，2;0，2;5，3;0，4;0 g，各加蒸餾水100 mL，浸泡30 min，加熱回流1 h，紗布過濾，濾液定容于100 mL量瓶中。精密量取提取液25 mL，置50 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1;0 mL，置25 mL量瓶中，同法處理后，于500 nm波長處測定吸光度并計算沙棘總黃酮提取量，結果見圖1?？梢姡S著β-CD加入量的增加，藥材中沙棘總黃酮的提取量逐漸增加，當β-CD加入量為2;0 g時，沙棘總黃酮提取量達到最大值。

圖1 β-CD加入量對沙棘總黃酮提取量的影響

2．4 β－CD輔助提取工藝與傳統(tǒng)工藝的比較

β-CD輔助提取法:稱取沙棘粗粉5 g，加入β-CD 2;0 g，加蒸餾水100 mL，浸泡30 min，加熱回流1 h，以紗布趁熱濾過，藥渣再加入β-CD 2;0 g，加蒸餾水100 mL，回流1h，濾過，合并兩次濾液，置250 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得提取液。

乙醇提取法［8］:稱取沙棘粗粉5 g，加60%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，紗布過濾，再重復提取1次，過濾，合并濾液，置250 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，得提取液。

水提取法:稱取沙棘粗粉5 g，加蒸餾水100 mL，浸泡30 min，煮沸回流1 h，紗布過濾，藥渣再加蒸餾水100 mL，繼續(xù)提取1 h，過濾，合并濾液，定容于250 mL量瓶中。

分別精密量取上述3種提取液25 mL，置50 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1;0 mL置25 mL量瓶中，同法處理后，于500 nm波長處測定吸光度，計算各自的沙棘總黃酮提取量及提取率;另分別取提取液10 mL，置已干燥恒重的坩堝中，在水浴上蒸干后，于90℃干燥至恒重，冷卻，精密稱定質量，計算浸膏中沙棘總黃酮含量。結果見表2?？梢?，3種提取法中，采用醇提法所得沙棘總黃酮提取量、提取率以及浸膏中沙棘總黃酮含量最高，其次為β-CD輔助提取法，水提取法最差。

表2 3種不同提取工藝試驗結果比較(n=3)

3 討論

在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用普通濾紙過濾沙棘提取液，濾紙容易堵塞而導致濾速緩慢，改用多層紗布過濾，效果較好。此外，因沙棘總黃酮水溶性較差，故提取液需趁熱過濾，否則，測定結果將偏低。需要注意的是，在采用β-CD輔助提取沙棘總黃酮過程中，當加入β-CD的量超過2 g時，β-CD與沙棘總黃酮所形成的部分包合物在溫度較低時可能以沉淀形式析出，也可導致測定結果偏低，故在過濾以及顯色操作過程中，應嚴格控制溫度條件。

β-CD加速沙棘總黃酮提取進程，提高提取率的主要機制為:在提取過程中，β-CD與沙棘總黃酮形成包合物［13］，從而增加了沙棘總黃酮的溶解度以及從藥材中溶出的速度;包合物的形成使提取液中沙棘總黃酮濃度降低，增大了藥材組織與提取液間的濃度梯度，從而加快了沙棘總黃酮的擴散速度［14-15］。

盡管β-CD輔助提取法的沙棘總黃酮提取量、提取率以及浸膏中沙棘總黃酮含量與傳統(tǒng)乙醇提取法比較，有顯著性差異(P＜0;05)，但仍明顯優(yōu)于水提取法。此外，該提取工藝生產成本低，安全性高，無環(huán)境污染，設備要求低，也適合于工業(yè)化規(guī)模生產，是一種具有潛在應用價值的沙棘總黃酮提取新工藝。同時，需要指出的是，新工藝在提取物中引入了一定量的β-CD，因而如何去除它仍有待進一步研究。

［1］國家藥典委員會;中華人民共和國藥典(一部)［M］;北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:171-172;

［2］金婷，徐雅琴，李興國;沙棘中活性物質及其應用［J］;沙棘，2005，18(2):24-25;

［3］李曉花，孔令學，劉洪章;沙棘有效成分研究進展［J］;吉林農業(yè)大學學報，2007，29(2):162-167;

［4］黃河勝，馬傳庚，陳志武;黃酮類化合物藥理作用研究進展［J］;中國中藥雜志，2000，25(10):589-592;

［5］于曉莉，潘雨利，侯永坤，等;沙棘提取物抗老齡鼠衰老作用的實驗研究［J］;白求恩醫(yī)科大學學報，2001，27(5):500-501;

［6］王尚義，鄭玉霞，劉聲普，等;水浸提沙棘葉總黃酮的工藝研究［J］;沙棘，2001，14(2):27-29;

［7］王元，王學軍;正交試驗法優(yōu)選沙棘葉總黃酮的提取條件［J］;甘肅科技，2009，25(21):159-160，210;

［8］劉樹英，鄭濤，劉俊男，等;沙棘黃酮提取方法比較研究［J］;安徽農業(yè)科學，2009，37(24):11 551-11 552，11 557;

［9］馬坤芳，王德旺，任勇;β-環(huán)糊精選擇性提取虎杖化學成分及體外抗內毒素活性研究［J］;上海中醫(yī)藥雜志，2008，42(8):81-82;

［10］張振海，劉力，徐德生;環(huán)糊精輔助提取丹參工藝的研究［J］;中成藥，2005，27(3):264-266;

［11］谷福根，韓磊，孟根達來，等;β-環(huán)糊精選擇性提取廣棗總黃酮的工藝研究［J］;中藥新藥與臨床藥理，2011，22(1):110-114;

［12］花仲卉，安雪梅，王偉內;比色法測定廣棗醇提物中總黃酮的含量［J］;海峽藥學，2003，15(6):36-38;

［13］任曉文，王玉麗，張士俊，等;β-環(huán)糊精對黃酮類結構包合作用的理論研究［J］;中草藥，2008，39(9):1 308-1 312;

［14］Stella VJ，He Q;Cyclodextrins［J］;Toxicol Pathol，2008，36(1):30-42;

［15］畢殿洲;藥劑學［M］;第4版;北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:186-188;

Study on Extraction Process of Total Flavones from Hippophae Fructus with β-Cyclodextrin

Wu Chunzhi1，Gu Fugen1，Shi Shuai2，Meng Gendalai1，Wang Yi1，Zhang Aiwu1
(1．Department of Pharmacy，Affiliated Hospital，Neimenggu Medical College，Huhehaote，Neimenggu，China010050;2．School of Pharmacy，Neimenggu Medical College，Huhehaote，Neimenggu，China010010)

ObjectiveTo study a new extraction process of total flavones from Hippophae(TFH)fructus with β-cyclodextrin(CD);Methods With β-CD as auxiliary material，TFH in Hippophae fructus was extracted;The total extraction amount and extraction rate of TFH as well as their percent content in the extract were simultaneously determined and compared with those from the traditional extraction processes such as the ethanol extraction and water extraction process;ResultsThe total extraction amount and extraction rate of TFH as well as their percent content in the extract from the new extraction process was nearly close to those from the ethanol extraction process，but the new process was significantly better than the water extraction method(P＜0;05);ConclusionThe new extraction process with β-CD as auxiliary material is of low cost，high safety，pollution-free and might has the important application prospects;

Hippophae fructus;total flavones;β-CD;complexation;extraction process;UV

TQ461;R284．1;R282．71

A

1006-4931(2012)14-0065-03

吳春芝(1968-)，女，大學本科，研究方向為醫(yī)院藥學以及環(huán)糊精包合物，(電話)0471-6637633(電子信箱) fgczh@sina;com;谷福根(1967-)，男，博士研究生，主任藥師，碩士生導師，主要從事環(huán)糊精包合物及藥物新劑型研究工作，本文通訊作者，(電話)0471-6637091(電子信箱)fgczh@sina;com。

2011-08-09)