薄荷醇合成關鍵酶基因的克隆

韓 瑞，王賢磊，高興旺，鐘 俐

(新疆大學，生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046)

薄荷醇合成關鍵酶基因的克隆

韓 瑞，王賢磊，高興旺，鐘 俐*

(新疆大學，生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊830046)

采用Trizol法從12℃處理48h的10d齡薄荷葉片中提取總RNA，通過RT－PCR方法擴增獲得薄荷醇合成關鍵酶基因cDNA(命名為LT，ST)，連接到pMD18－T載體上，命名為pMD18－T－LT，pMD18－T－ST。結果表明:擴增的薄荷醇合成酶片段全長約1125bp和942bp。將獲得的基因成功構建到植物表達載體pCAMBIA1301上，經轉化根癌農桿菌GV3101，經菌落PCR進一步鑒定轉化結果。實驗結果為進一步從分子水平挖掘并利用薄荷醇合成酶關鍵基因奠定基礎。

薄荷，薄荷醇合成酶，基因克隆

1 材料與方法

1.1 實驗材料

薄荷(M.haplocalyx Briq) 由中國工程院吳明珠院士提供;大腸桿菌 DH5α，植物表達載體pCAMBIA1301，根癌農桿菌 GV3101;Trizol，DEPC，Hygromycin，PCR相關試劑;引物 由Takara公司合成;反轉錄試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，pMD18－T vector試劑盒，限制性內切酶Sal I，Sam I，T4DNA連接酶，PCR引物;YEB固體培養基 含50mg/L Kan，50mg/L Rif，50mg/L Gen。

1.2 實驗方法

1.2.1 薄荷醇合成關鍵酶基因的克隆

1.2.1.1 植物材料的處理 取適量干燥的薄荷種子在超凈工作臺中加入75%的乙醇浸泡10min，用滅菌蒸餾水漂洗播布于MS固體培養基，4℃純化7d后移至光照培養箱中進行光照培養，培養條件為:光照16h，25℃/黑暗8h，19℃;待長出2片真葉，移栽到蛭石/珍珠巖≈3∶1培養基質中光照培養。

1.2.1.2 總RNA的提取 采用Trizol法［14］提取薄荷總RNA，保存于－80℃冰箱待用。

1.2.1.3 cDNA的合成 取11μL RNA為模板，加入相應的試劑與引物，反轉錄條件:42℃，60min;70℃，10min，冰上冷卻，合成cDNA第一鏈。以反轉錄產物為模板進行PCR擴增目的cDNA的第二條鏈，PCR反應條件:(LT)94℃，5min;94℃，30s;40℃，40s; 72℃，60s;72℃，7min，35循環;(ST)94℃，5min; 94℃，30s;50℃，40s;72℃，60s;72℃，7min，35循環。1.2.1.4 引物設計 以Genbank中公布的薄荷醇合成關鍵酶基因序列為模板，用Primer Premier 5軟件設計特異引物。

引物 LT－1序列為:ATGGCTCTAAAGTGTT AAGTGG;引物LT－2序列為:TCATGCAAAGGGC TCGAATA;引物ST－1序列為:ATGGCCATTAATCTC TCCCATA;引物 ST－2序列為:CTAAGCCGCG TAAAGGCTCG。

引物用時先4000r/min離心2min，然后按照引物單上說明加相應體積 ddH2O稀釋成10μmol/L，－20℃貯存備用。

1.2.1.5 RT－PCR產物的純化和克隆測序 經瓊脂糖凝膠電泳檢測的RT－PCR產物，采用DNA凝膠回收試劑盒進行回收。純化的PCR產物在T4DNA連接酶的作用下3000r/min離心10s，置4℃冰箱過夜反應。連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，Amp濃度100mg/L，菌落PCR法篩選陽性克隆，并用SDS堿裂解法小量提取質粒進行鑒定。將重組質粒pMD18－T－LT，pMD18－T－ST的菌液送北京華大生物工程有限公司測序。

1.2.2 植物表達載體的構建［15－17］SDS堿裂解法中量制備載體pCAMBIA1301，用SalI和SamI進行雙酶切質粒 pMD18－T－LT，pMD18－T－ST及載體pCAMBIA1301并回收。將回收的目的條帶用 T4DNA ligase于 16℃ 過夜連接，得到重組質粒pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST。

1.2.3 重組質粒的鑒定 重組質粒pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST的轉化同1.2.1.5，不同之處是將Amp改為Kan，且Kan終濃度為50mg/L;采用菌落PCR鑒定和雙酶切鑒定的方法篩選陽性單克隆，陽性菌液加20%滅菌甘油后于－70℃冰箱保存。

1.2.4 轉化根癌農桿菌 SDS堿裂解法小量制備重組質粒pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST，制備根癌農桿菌GV3101感受態細胞，采用反復凍融法將提取的重組質粒pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST轉化至制備好的根癌農桿菌GV3101感受態細胞中。將根癌農桿菌 GV3101菌株(攜帶有pCAMBIA1301－LT，pCAMBIA1301－ST)接種到YEB固體培養基，28℃黑暗培養2d。

1.2.5 篩選鑒定陽性克隆 采用菌落PCR鑒定和質粒鑒定的方法篩選陽性單克隆。挑取單克隆接種于YEB液體培養基，28℃、220r/min避光振蕩培養約48h;振蕩培養至OD600為0.5左右，SDS堿裂解法小量制備重組質粒，進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定無誤后將陽性菌液加20%滅菌甘油后于－70℃冰箱保存。

2 結果與分析

2.1 薄荷醇合成關鍵酶基因克隆

2.1.1 總RNA的提取 經 Trizol法提取總RNA，0.7%瓊脂糖電泳檢測(圖1)，條帶清晰整齊，無降解，所得RNA完整，可以進行反轉錄。

圖1 薄荷總RNAFig.1 Total RNA of peppermint

2.1.2 薄荷醇合成關鍵酶基因克隆及回收的結果利用設計的特異引物經35個循環RT－PCR擴增，獲得了大約為1140bp和960bp的片段，目的條帶單一，特異性強(圖2)。PCR擴增產物經片段回收，在T4DNA連接酶的作用下連接并轉化E.coli DH5α感受態細胞。

圖2 薄荷醇合成酶關鍵基因RT－PCR擴增結果Fig.2 Menthol capital synthase gene amplified by RT－PCR

2.1.3 薄荷醇合成關鍵酶基因的序列分析 經雙向測序后拼接，獲得薄荷醇合成關鍵酶基因序列全長，基因LT和ST全長分別為1125bp和942bp，編碼375個和313個氨基酸。用DNAMAN軟件分析得出:兩對基因分別達到97.33%和100%的同源性。

2.2 植物表達載體的構建

2.2.1 重組質粒pMD18－T－LT、pMD18－T－ST與載體pCAMBIA1301酶切并回收 采用 SDS堿裂解法［8］中量制備重組質粒pMD18－T－LT、pMD18－T－ST和載體質粒pCAMBIA1301，經SalI和SamI雙酶切后，大小與預計相符，說明質粒 pMD18－T－LT、pMD18－T－ST已切開(圖3)。

圖3 SalI和SamI雙酶切鑒定重組質粒Fig.3 Recombinant plasmid digested by SalI and SamI

2.2.2 重組質粒pCAMBIA1301－LT、pCAMBIA1301－ ST的鑒定 以薄荷醇合成酶關鍵基因引物LT－1/LT－2、ST－1/ST－2進行菌落PCR后電泳顯示，條帶大小相符，且亮度高，初步說明薄荷醇合成酶關鍵基因已成功連接到表達載體pCAMBIA1301上(圖4)。小提重組質粒用SalI和SamI進行雙酶切，電泳成像后顯示出兩條帶，且大小與預計相符，從而進一步證明薄荷醇合成酶關鍵基因已成功連接到表達載體pCAMBIA1301上(圖5)。

圖4 菌落PCR鑒定重組質粒Fig.4 Recombinant plasmid identified by PCR

圖5 雙酶切鑒定重組質粒Fig.5 Recombinant plasmid digested

2.2.3 重組質粒pCAMBIA1301－LT、pCAMBIA1301－ST轉化根癌農桿菌鑒定 小量制備重組質粒pCAMBIA1301－LT、pCAMBIA1301－ST，條帶大小相符，且亮度高，說明質粒濃度較高(圖6)。以薄荷醇合成酶關鍵基因引物LT－1/LT－2、ST－1/ST－2進行菌落PCR后電泳顯示，條帶大小相符，且亮度高，說明薄荷醇合成酶關鍵基因已轉化到根癌農桿菌GV3101中(圖7)。

圖6 質粒鑒定Fig.6 Plasmid identified by PCR

3 結論

實驗采用Trizol法從12℃處理48h的10d薄荷葉片中提取總RNA，利用RT－PCR技術，克隆得兩對薄荷醇合成關鍵酶基因，與Genbank中的薄荷醇合成關鍵酶基因相比對，核苷酸的同源性分別為97.33%和 100%。并成功構建到植物表達載體pCAMBIA1301上，經轉化根癌農桿菌，經菌落PCR和質粒進一步鑒定轉化結果。

圖7 菌落PCR鑒定Fig.7 Plasmid digested

目前食品風味的改善及風味物質的生產，已成為廣大食品研究者和生產者關注的熱點。對風味酶的深入研究是食品生物化學的一項重要任務。利用生物技術生產的風味物質天然風味醇厚且不受原料、地區限制，克服了從動植物中天然提取的困難，而且用生物轉化法生產的風味酶被美國和歐盟認為是天然產物，國內在此方面的研究和應用剛起步。

甜瓜是新疆重要的特色經濟作物。新疆甜瓜以其特有的優良風味和品質享譽國內外［19］。但甜瓜生產缺乏具有特色的新型品種，局限于原始的種植資源加之傳統的栽培育種技術周期長［18］。薄荷醇作為一種獨特的風味酶，利用風味酶在食品風味的再現、強化和改變方面的應用，并使用分子標記、分子克隆和轉基因等技術，轉基因技術將成為改善甜瓜種質的一個重要方法。利用分子克隆技術或人工改造和合成具有某一特性的基因(如薄荷醇合成關鍵酶基因)，轉移到供體甜瓜中去，就可獲得前所未有的、利用常規育種難以獲得的新種質，為甜瓜育種開辟新的道路，也為應用遺傳轉化手段獲得新基因培育特色風味甜瓜新品種奠定良好的基礎。

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Clone of menthol capital synthase gene

HAN Rui，WANG Xian－lei，GAO Xing－wang，ZHONG Li*
(College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

The method of Trizol was extracted to the total RNA from 10th day peppermint leaf which was processed about 48h under 12℃，RT－PCR was employed to clone cDNA fragment of menthol synzyme gene(named for LT，ST).The purpose fragments named pMD18－T－LT、pMD18－T－ST which were connected on the pMD18－T vector. The result indicated:Sequence length of LT and ST were about 1125bp and 942bp.The coloned genes were introduced into the plant expression vector pCAMBIA1301 and transformed into Agrobacterium tumefaciens GV3101.Colony PCR was employed to evaluate transformation result.The study provided material for further exploring menthol synzyme gene in molecular level.

peppermint;menthol synthase;gene cloning

Q785

A

1002－0306(2012)08－0239－04

薄荷為唇形科薄荷屬植物(M.haplocalyx Briq)［1］，是一種多年生草本植物，有特異芳香氣味，具宜風退熱、解郁疏氣、祛風止癢、健胃止痛等作用［2］。薄荷醇，俗名薄荷腦，學名5－甲基－2－異丙基－環己醇，是重要的單環萜醇。左旋薄荷醇具有薄荷香氣和清涼作用，消旋薄荷醇也有清涼作用，其它異構體無清涼作用［3］。薄荷醇作為一種重要香原料和傳統的清涼劑，在醫藥衛生方面的應用比例較大，如使心血管舒張、抑止呼吸、止咳、輔助消化、解心情急躁綜合癥等功效，其次用于香料如煙草香料［4］、牙膏香精、花露水等，還可以作為多種食品的調味劑。薄荷醇合成關鍵酶(GPP合成酶)為萜類合成中重要的限速酶［5］，可催化兩個異構的IPP分子合成為牦牛兒基焦磷酸［6－8］，GPP合成酶在多種植物中都有分離報道，但對該酶的研究多數停留在酶的一般研究水平上。其較少研究發現該酶是由一個功能異構的二聚體組成，分別帶有大小兩個亞基［9－11］(下文用LT、ST表示)。本實驗從薄荷中克隆GPP合成酶基因，構建植物表達載體。最終采用基因工程技術的方法，為提高薄荷醇生物合成水平，改善食品的營養價值和風味品質，改造遺傳物質［12－13］，優化種植資源奠定基礎。

2011－07－18 *通訊聯系人

韓瑞(1987－)，女，在讀碩士，主要從事植物分子生物學方面的研究。

國家自然基金(31060148)。