濃香型皇臺大曲可培養細菌群落結構及其產淀粉酶的研究

陳 林，趙志瑞，王 菲，任迪峰，*，李祖明，白志輝

(1.北京林業大學生物科學與技術學院，北京100083;2.北京聯合大學應用文理學院，北京100191; 3.中國科學院生態環境研究中心，北京100085)

濃香型皇臺大曲可培養細菌群落結構及其產淀粉酶的研究

陳 林1，趙志瑞3，王 菲1，任迪峰1，*，李祖明2，*，白志輝3

(1.北京林業大學生物科學與技術學院，北京100083;2.北京聯合大學應用文理學院，北京100191; 3.中國科學院生態環境研究中心，北京100085)

采用稀釋平板法，從濃香型皇臺大曲中分離純化出73株細菌菌株，經PCR擴增其16S rDNA并測序，比對分析發現這些純化的細菌菌株中有23株16S rDNA序列各異的可培養細菌，這些菌株分別為Bacillus licheniformis 16株、Bacillus subtilis 2株、Bacillus amyloliquefaciens 1株、Bacillus cereus 1株、Bacillus atrophaeus 1株、Bacillus sonorensis 1株和Brevibacillus sp.1株;采用透明圈法和液態發酵法對大曲中可培養細菌產淀粉酶性能進行檢測，結果表明Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis和Bacillus cereus的一些菌株產淀粉酶的活性較高，其中，Bacillus licheniformis的數量最多，是重要的白酒釀造功能菌。

濃香型大曲，細菌群落結構，16S rDNA，淀粉酶

白酒是我國傳統的發酵食品，有著悠久的歷史。科學技術與釀酒業的發展和酒曲的深入研究，極大地推動了制曲釀酒行業迅猛發展［1－2］。釀酒微生物的種類、數量、分布及其消長變化等對發酵途徑及最終產物的生成有著重大的影響，進而影響著白酒的質量［3］。大曲作為一種多酶多菌的微生態制品在白酒釀制中起糖化、發酵和增香的作用［4－6］。大曲是白酒發酵生產中微生物的主要來源，大曲含有豐富的細菌，其各種代謝產物對白酒香型和風格具有重要作用［3，7］。基于傳統的表型分類和生理生化鑒定不能準確表現細菌之間的遺傳進化關系，以分子生物學為基礎的聚合酶鏈式反應(PCR)技術速度快、準確度高，受到越來越多的關注［8－10］。“南有茅臺、北有皇臺”，皇臺酒是北方濃香型白酒的代表［11］。在前期對皇臺酒曲酶系及其生化性能等研究基礎上［11］，本文采用PCR技術對皇臺酒曲細菌的群落結構進行了研究，并采用透明圈法和液態發酵法對酒曲細菌產淀粉酶的性能作了初步研究，這有利于揭示白酒釀造的機理和實現白酒生產的科學化和現代化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

酒曲 由甘肅皇臺釀造(集團)有限責任公司提供;肉膏蛋白胨培養基(g) 牛肉膏0.5，蛋白胨1， NaCl 0.5，瓊脂1.5～2，水100mL，pH7.2;淀粉培養基 可溶性淀粉2%，蛋白胨1%，NaCl 0.05%，瓊脂2%，pH7.2;種子培養基 牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH7.2;搖瓶培養基 可溶性淀粉2%，蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，調pH7.2;滅菌溫度121℃，滅菌時間20min;通用引物27F、1495R 由上海竹工公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒曲微生物的分離純化

1.2.1.1 酒曲懸液的制備 用滅過菌的小刀，除去曲坯表面，于內部取曲粉5g，用無菌的研缽研碎成粉。在無菌環境稱取要分離酒曲粉1g，放入含有玻璃珠的滅菌三角瓶中，用99mL無菌生理鹽水稀釋，在搖床上振蕩15min混勻即為1∶100的稀釋液。用滅菌吸管吸取1∶100稀釋液0.5mL，沿管壁徐徐注入含有4.5mL無菌生理鹽水的試管中，振搖試管混合均勻，制成1∶1000的稀釋液。另取滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋液，一直稀釋到10－8倍為止。

1.2.1.2 稀釋涂平板 用滅菌吸管從稀釋度為10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8的稀釋液中吸取0.1mL菌液分別涂肉膏蛋白胨培養基平板3塊。

1.2.1.3 培養 倒置培養皿，在培養溫度為36℃的恒溫培養箱中培養一段時間，菌落長成后即可計數。

1.2.1.4 菌落計數、形態描述、純化培養 對長出的菌落進行計數、形態描述，然后挑取平板上的單菌落分別在肉膏蛋白胨培養基上進行劃線分離，于36℃下培養一段時間，進一步純化，直到得到單一菌落。

1.2.1.5 斜面保存 挑取純化后的單個菌落，接入肉膏蛋白胨斜面培養基斜面中保存備用。

1.2.2 細菌16S rDNA測序分析

1.2.2.1 PCR 16S rDNA擴增:引物為通用引物27F和 1495R［12］，其 序 列:正 向 引 物:5’－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3’;反向引物:5’－TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3’。

聚合酶鏈式反應(PCR):反應體積為50μL;擴增條件為 95℃ 5min，94℃ 1min，52℃ 1min，72℃1.5min，30個循環;72℃下延伸7min。PCR產物經切膠純化回收后送北京六合華大基因測序公司測序。

1.2.2.2 測序和分析 將所得16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中的已知序列進行Blast比較，找到與分離菌株親緣關系最近的種屬。并從數據庫獲得相關種屬中相似性最高菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA3.1進行比對，用N－J法構建系統發育樹。

1.2.3 細菌產淀粉酶的測定

1.2.3.1 初篩 將分離純化菌株點種于淀粉培養基平板［13］上，于36℃恒溫培養箱中培養一段時間，菌落長成后向平板中倒入碘液顯色，觀察并測定透明圈直徑和菌落直徑的大小，并計算其比值(HC值)，初步篩選出產淀粉酶優良的菌株。

1.2.3.2 淀粉酶的制備 將透明圈法篩選出來的產淀粉酶的菌株接種于細菌種子培養基上(20mL于150mL錐形瓶中)，于搖床180r/min 36℃培養24h，得種子液，按6%接種于細菌淀粉酶搖瓶培養基(50mL于250mL錐形瓶中)，于搖床180r/min 36℃培養48h，取發酵液于離心管中，8000r/min，4℃，離心15min，取上清液即為淀粉酶粗酶液，于冰箱保存備用，測淀粉酶活力。

1.2.3.3 淀粉酶活力測定 將粗酶液稀釋代替蒸餾水，用2%可溶性淀粉溶液作為底物按照上述操作，660nm下測吸光度A，通過標準曲線查出相應的淀粉濃度，即被酶消耗的淀粉量。

1.2.3.4 酶活力計算 酶活力以每毫升粗酶液在60℃，pH6.0的條件下每小時所分解的淀粉微克數來衡量。

2 結果與分析

2.1 群落結構解析

2.1.1 分離篩選 通過倍比稀釋法和平板劃線分離法，對濃香型皇臺酒曲中細菌進行分離和純化，從中篩選出細菌73株，通過16S rDNA的分子鑒定可進一步確定這些菌株的種屬關系。

2.1.2 群落結構解析 對從酒曲中分離篩選的細菌菌株的16S rDNA進行PCR，并對純化后的PCR產物進行測序，獲得皇臺酒曲細菌菌株的16S rDNA全序列，與GeneBank中序列比對確定細菌種屬。一般認為，細菌16S rDNA序列相似性大于99%可以認為是相同的種。本文又將16S rDNA序列相似性為100%的菌株合并為相同的菌株，序列遞交GenBank數據庫，獲得登錄號。結果見表1。皇臺酒曲細菌菌株系統進化樹見圖1(A和B)。

皇臺酒曲中 73株菌株中包括 Bacillus licheniformis 44株，占 60.3%;Bacillus cereus 10株; Bacillussubtilis7 株;Bacillus sonorensis7 株; Brevibacillus sp.3株;Bacillus amyloliquefaciens 1株和Bacillus atrophaeus 1株。菌株的16S rDNA序列完全相同的合并后，得到23株不同菌株，分別為Bacillus licheniformis 16 株、Bacillussubtilis 2 株、Bacillus amyloliquefaciens 1株、Bacillus cereus 1株、Bacillus atrophaeus 1株、Bacillus sonorensis 1株和Brevibacillus sp.1株。可見，濃香型皇臺酒曲細菌數量繁多、種類豐富，芽孢桿菌是優勢菌。

芽孢桿菌廣泛存在于酒曲中。研究人員分別采用不同方法從瀘州國窖酒曲［14］、茅臺高溫大曲［15］、汾酒酒曲［16］中分離檢測出不同芽孢桿菌菌種。相關文獻報道地衣芽孢桿菌是醬香型白酒高溫大曲中特有微生物［17］，和本文研究結果一致。莊名揚等［18］采用純培養和經典鑒定發現醬香型白酒的功能菌B3－1菌株屬地衣芽孢桿菌。牛欄山二鍋頭清香型大曲中地衣芽孢桿菌的應用為提高牛欄山二鍋頭基酒質量提供了良好的途徑［19］。

除地衣芽孢桿菌外，枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌也是皇臺大曲中重要的功能菌群。枯草芽孢桿菌［20］在醬香生產中起重要作用。蠟狀芽孢桿菌［21］有較強的分泌淀粉酶能力。目前還未見 Bacillus sonorensis、Brevibacillus sp.、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus atrophaeus存在于其他大曲的文獻報道。以上對濃香型皇臺大曲細菌群落結構的研究為其深入研究和應用奠定了基礎，有利于揭示濃香型白酒釀造的微生物學機制。

2.2 酒曲中產淀粉酶的細菌

淀粉酶是能水解淀粉轉化成葡萄糖、麥芽糖及一些低聚糖的一類酶的總稱，廣泛應用于釀酒、食品、醫藥、紡織、飼料等領域［21］。淀粉酶可將淀粉液化和糖化，有利于白酒釀造，是白酒生產中必需的重要酶類，其酶活的高低極大地影響原料利用率、白酒產率及風味品質。目前分離產淀粉酶細菌的方法，主要是使用淀粉培養基進行分離，然后用碘液染色檢測透明圈的大小，從而鑒定出產淀粉酶的菌株［22］。對篩選出來的甘肅皇臺酒曲中的細菌進行淀粉平板透明圈實驗，得到產淀粉酶的菌株，并將這些菌株進行接種發酵，研究其產淀粉酶的性能，結果見表2。

從甘肅皇臺酒曲中分離純化的73個細菌菌株中，有12株(見表2)能在淀粉平板中形成明顯的透明圈，說明它們能產生淀粉酶;其中 Bacillus licheniformis 5株，占41.7%，是皇臺大曲中產淀粉酶細菌的優勢菌;Bacillus subtilis 3株，Bacillus cereus 2株，Bacillus sonorensis 2株，而 Brevibacillus brevis和Bacillus atrophaeus未產生明顯的淀粉透明圈。由表2可知，不同酒曲細菌菌株產淀粉酶活力有所不同; Brevibacillus sp.和Bacillus atrophaeus中沒有發現明顯產淀粉酶的菌株，這與透明圈實驗結果相一致。另一方面，不同的細菌菌株，即便是16S rDNA序列完全相同，它們產淀粉酶的能力差別仍然較大，因此，從分類學上嚴格劃分，它們可能不是相同的菌株，或許劃分為亞種水平更準確，還有待深入研究。

表2 酒曲細菌產淀粉酶Table 2 Amylase－producing bacteria from Daqu

目前已有學者從酒曲中分離出具有產淀粉酶活性的菌株。翁慶北［23－24］等從茅臺酒曲和習酒酒曲里得到產淀粉酶的多種芽孢桿菌，如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌等;可以看出地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均是大曲細菌中產淀粉酶的重要菌群。未見大曲中Bacillus sonorensis和Bacillus amyloliquefaciens產淀粉酶的文獻報道。

圖1 皇臺酒曲細菌菌株系統進化關系樹Fig.1 Phlogenetic analysis of Huangtai cultivable bacteria

3 結論

本文對濃香型皇臺大曲中細菌進行分離篩選得到73株細菌。經過16S rDNA擴增測序后發現Bacillus licheniformis占總數量的60.3%，是大曲的優勢菌，其次為Bacillus cereus和Bacillus subtilis;未見Bacillus sonorensis、 Brevibacillus brevis、 Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus atrophaeus存在于其他大曲的文獻報道。發酵產淀粉酶性能研究發現Bacillus licheniformis數量上占明顯優勢，所產淀粉酶活力較高;未見大曲中Bacillus sonorensis產淀粉酶的文獻報道。初步研究發現不同細菌菌株，即便是16S rDNA序列完全相同，它們產淀粉酶的能力差別仍然較大。因此，后續工作將對產淀粉酶能力差異大且具有相同序列的菌株在亞種水平劃分進行深入研究。

［1］傅金泉.中國酒曲技術的發展與展望［J］.釀酒，2002，29 (3):7－9.

［2］吳衍庸.白酒工業微生物資源的發掘與應用［J］.釀酒科技，2006(11):111－115.

［3］敞顏，趙輝，凌宏志.傳統白酒發酵微生物的研究進展［J］.食品工業科技，2010，31(9):425－427，431.

［4］任飛，周紅海，韓珍瓊.夏季濃香型大曲生產的工藝控制［J］.釀酒科技，2007(8):56－58.

［5］許德富，沈才萍.制約大曲質量品質的條件剖析及前景展望［J］.釀酒科技，2002(8):33－34.

［6］唐玉明，沈才洪.酒曲理化品質指標相關性探討［J］.釀酒科技，2006(7):37－41.

［7］羅惠波，黃治國，李浩.濃香型大曲原核微生物群里的PCR－SSCP解析［J］.微生物學通報，2009，36(9):1363－1367.

［8］羅俊成，胡佳.酒醅中芽孢桿菌屬細菌的16S rDNA全序列系統學分析［J］.釀酒科技，2007(2):17－19.

［9］張文學，喬宗偉，胡承，等.PCR技術對濃香型白酒糟醅細菌菌群的解析［J］.四川大學學報:工程科學版，2005，37(5): 82－87.

［10］羅惠波，黃治國，李浩.濃香型大曲微生物群落結構的PCR－SSCP解析條件優化［J］.四川理工學院學報:自然科學版，2009(4):72－74.

［11］李祖明，李玉輝，劉世云，等.皇臺酒曲于德山大曲酒曲的比較研究［J］.釀酒科技，2009(1):27－29.

［12］Takeshi Watanabe，Susumu Asakawa，Asumi Nakamura，et al.DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in paddy field soil［J］.FEMS Microbiology Letters，2004，232:153－163.

［13］徐良玉，石貴陽，陶飛，等.快速篩選耐酸性α－淀粉酶產生菌株的平板透明圈法［J］.錫輕工大學學報，2003(5):91－94.

［14］姚萬春，唐玉明，任道群，等.瀘州老窖國窖窖曲坯層次間微生物差異研究［J］.釀酒，2005(5):35－36.

［15］楊代永，范光先，汪地強，等.高溫大曲中的微生物研究［J］.釀酒科技，2007(5):37－41.

［16］李超，穆琳，王建耀，等.汾型大曲的理化指標和微生物指標分析［J］.中國釀造，2009(1):140－142.

［17］張榮，徐巖，范文來.醬香型大曲中地衣芽孢桿菌及其特征風味代謝產物的分析研究［J］.工業微生物，2010，40(3): 7－12.

［18］莊名揚，王仲文.醬香型高溫大曲中功能菌B3－1菌株的分離、選育及其分類學鑒定［J］.釀酒，2003，30(1):81－82.

［19］劉桂君，劉紅霞，胡建華，等.地衣芽孢桿菌在牛欄山二鍋頭基酒生產中的應用［J］.釀酒科技，2009(8):83－87.

［20］李賢柏.郎酒高溫大曲產醬香細菌的研究［J］.重慶師范學院學報:自然科學版，1997，14(4):20－23.

［21］劉洋，陳愛萍，朱小順，等.一株蠟狀芽孢桿菌α－淀粉酶產生菌株的分離鑒定及酶學性質研究［J］.中國釀造，2010 (8):68－71.

［22］李蘭，楊天佑，代雪原，等.白酒大曲中產淀粉酶細菌的快速分離［J］.河南科技學院學報，2009，37(2):42－44.

［23］翁慶北，趙維娜，萬晴姣，等.茅臺酒曲中產淀粉酶細菌分離及性質［J］.貴州師范大學學報:自然科學版，2005，23(2): 20－22，28.

［24］翁慶北，趙維娜，萬晴姣.習酒酒曲中產淀粉酶細菌分離及性質研究［J］.釀酒科技，2006(1):21－22，26.

Study on the cultivable bacterial community structure and amylase in Huangtai Liquor Daqu

CHEN Lin1，ZHAO Zhi－rui3，WANG Fei1，REN Di－feng1，*，LI Zu－ming2，*，BAI Zhi－hui3
(1.College of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China; 2.College of Arts and Science of Beijing Union University，Beijing 100191，China; 3.Research Centre for Eco－Environmental Sciences，Chinese Academy of Science，Beijing 100085，China)

The cultivable bacterial community structure in Huangtai Liquor Daqu was assessed by dilution plate method and 16S rDNA gene directed PCR.The producing ainglase property of bacteria in the Daqu was investigated by clear zone and submerged fermentation(SmF).23 strains of cultivable bacteria isolated from HuangtaiDaqu were identified as Bacillus licheniformis，Bacillus subtilis，Bacillus cereus，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus atrophaeus，Bacillus sonerensis and Brevibacillus sp.respectively.That the strains of Bacillus licheniformis produced amylase were the most abundant bacteria in the Daqu，as well as effective amylase producer.Bacillus licheniformis might play an important role in the brewing of Huangtai liquor.

luzhou－flavor Daqu;bacterial community structure;16S rDNA;amylase

TS201.3

A

1002－0306(2012)08－0232－05

2011－06－10 *通訊聯系人

陳林(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:農產品加工與貯藏。

中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(YX2011－21，TD2010－3);北京市教委科研計劃項目(KM200811417006);北京市屬市管高校人才強教計劃資助項目。