響應面法分析優(yōu)化米曲霉產β-葡萄糖苷酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基

朱 婧，王青艷，，劉演景，申乃坤，陳桂光，梁智群，*

(1.廣西科學院國家非糧生物質能源工程技術研究中心，廣西南寧530007; 2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530005)

響應面法分析優(yōu)化米曲霉產β-葡萄糖苷酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基

朱 婧1，王青艷1，2，劉演景2，申乃坤1，陳桂光2，梁智群2，*

(1.廣西科學院國家非糧生物質能源工程技術研究中心，廣西南寧530007; 2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530005)

利用快速有效的響應面分析法對米曲霉ASPE0485產β－葡萄糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，利用Plackett－Burman顯著因子實驗和Box－Behnken響應面分析優(yōu)化了β－葡萄糖苷酶產生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，確定搖瓶發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成為(%，w/v):玉米芯3.8%、大豆蛋白胨0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.05%、吐溫－80 0.27%和接種量5.3%;在此條件下發(fā)酵，得到酶活為21.1U/mL比原始酶活(17.65U/mL)提高了19.55%。

米曲霉，β－葡萄糖苷酶，響應面分析法

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米曲霉ASPE0485(Aspergillus oryzae ASPE0485)廣西大學生命科學與技術學院食品與發(fā)酵工程研究所篩選并保藏;斜面培養(yǎng)基 10%(w/v)麩皮水煮30min，4層紗布過濾，濾液中添加2%葡萄糖，2%瓊脂，pH自然;種子培養(yǎng)基 50mL Mandels［4］微量元素鹽溶液中加入1%(W/V)植物蛋白胨，pH自然［5］;基礎搖瓶培養(yǎng)基 3%(W/V)玉米芯，0.2%(W/V)植物蛋白胨，0.4%(W/V)KH2PO4，0.04%(W/V)CaCl2，0.04%(W/V)MgSO4，pH自然，定容至50mL［4］。

表2 PB設計及其實驗結果Table 2 Experimental design and results of the PB

表3 PB設計的回歸分析結果Table 3 Results of the PB regression analysis

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子液培養(yǎng)方法:250mL三角瓶裝液量50mL，每瓶種子培養(yǎng)基的接種量為1×106個孢子，培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉速為160r/min，培養(yǎng)時間為12h。

發(fā)酵培養(yǎng)方法:250mL三角瓶裝液量50mL，種子液以2%(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉速為160r/min，培養(yǎng)時間為4d。

1.2.2 酶活力的測定

1.2.2.1 酶活力測定 以0.5%水楊苷為底物，準備兩管平行樣及一個空白對照，各加入0.9mL底物(0.5%水楊苷)之后，各加入0.lmL酶液(以10s為間隔加樣)，空白對照以滅活的酶樣代替，50℃反應30min后，測定OD540。

1.2.2.2 酶活力定義 在此反應條件下(pH為4.8，溫度為50℃)，每分鐘每毫升酶液生成1μmol還原糖的酶量即一個酶活單位U，用U/mL表示［6］。

1.2.3 Plackett－Burman(PB)設計優(yōu)化［7］選取7個因素，實際實驗次數(shù)16次的Plackett－Burman(PB)設計，響應值為β－葡萄糖苷酶酶活，為估計誤差增加4個中心點，實驗重復三次，實驗結果取3次的平均值。

1.2.4 最陡爬坡實驗 以實驗值變化的梯度方向為最陡爬坡法爬坡方向，根據(jù)各因素效應值的大小確定變化步長逼近最佳值區(qū)域，初步估算響應面實驗的中心點。

1.2.5 Box－Benhnken中心組合實驗設計［8－9］根據(jù)Box－Benhnken中心組合實驗設計原理，由Plackett－Burman實驗篩選出的三個顯著因子，并以最陡爬坡實驗結果確定實驗水平，設計了3因素3水平共15個實驗點的響應面分析，如表1。

表1 Box－Behnken分析實驗因素水平表Table 1 Levels of the variables in the Box－Behnken design

本實驗用統(tǒng)計分析軟件Minitab對實驗結果進行分析。每次實驗重復三次，每次三個平行。

2 結果與分析

2.1 Plackett－Burman(PB)設計實驗結果

實驗選用n=16的Plackett－Burman設計安排，各因素水平取值，實驗設計及結果分別見表2。

利用Minitab軟件分析各因素的主效應，結果見表3，7個因素中對響應值影響的顯著性順序為:玉米芯＞吐溫－80＞接種量＞KH2PO4＞CaCl2＞大豆蛋白胨＞MgSO4·7H2O。實驗中R2=0.9665。且根據(jù)表3中P值可知，玉米芯濃度、吐溫－80濃度、接種量這3個因素的可信度都在90%以上，對β－葡萄糖苷酶產量影響顯著，可考慮作為主要因素進一步響應面實驗，在其后的實驗中其他因素均為中心點水平。

2.2 最陡爬坡實驗結果

響應面的擬合方程在考察的緊接鄰域里才能充分近似真實的情形，因此要先逼近最佳值區(qū)域，才可以建立有效的響應面擬合方程。所以根據(jù)3個因素效應大小的比例設定它們的變化方向及步長進行實驗，設計及結果如表4所示。可見，最優(yōu)發(fā)酵條件在實驗2與實驗3之間，有顯著正效應，故以實驗2的條件為響應面實驗的中心點。

表4 最陡爬坡實驗設計和結果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 Box－Behnken設計和響應面分析實驗結果

依據(jù)Plackett－Burman實驗和最陡爬坡實驗確定的3因素，分別為X1、X2、X3，根據(jù)Box－Benhnken的中心組合實驗設計原理，進行3因素3水平共15個實驗點的實驗設計，實驗設計及結果見表5、表6。

表5 Box－Behnken實驗設計與結果Table 5 Experimental design and response of the Box－Behnken

利用Minitab統(tǒng)計軟件回歸擬合實驗數(shù)據(jù)(表6)可獲得三元二次回歸方程為:

回歸方程方差分析顯著性檢驗表明(表7)，該模型失擬不顯著，回歸顯著。并且該模型決定系數(shù)R2=0.9772，離回歸標準差S=0.67735，說明回歸方程的擬合程度較好，預測值和實測值之間具有高度的相關性可以應用于β－葡萄糖苷酶生產的理論預測。

表6 Box－Behnken實驗的回歸分析結果Table 6 Results of the Box－Behnken regression analysis

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance and regression for the selected quadratic model

2.4 培養(yǎng)基最適組合

根據(jù)回歸方程可以利用Minitab繪出響應面分析圖及其等高線，證實了擬合面有真實的極大值，見圖1～圖3。得出模型的極值點為:玉米芯濃度為3.824%(3.8%)，吐溫－80濃度為0.265%(0.27%)，接種量為5.266%(5.3%)，此時模型預測的極大值為21.80U/mL。

圖1 響應面法(X1，X2)立體分析圖Fig.1 3D surface map of response surface(X1，X2)

2.5 回歸模型的驗證

在以上優(yōu)化條件下進行驗證實驗，共進行5批次250mL搖瓶實驗，取平均值為21.1U/mL。該結果與模型預測基本一致，表明所得的模型有一定的實驗指導意義。

3 結論與討論

現(xiàn)在許多研究工作顯示在微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化工作中，合理地使用Plackett－Burman和響應面分析法，能取得良好的效果，可以使研究、生產者在更廣泛的范圍內考慮因素的組合。

圖2 響應面法(X1，X3)立體分析圖Fig.2 3D surface map of Response surface(X1，X3)

圖3 響應面法(X2，X3)立體分析圖Fig.3 3D surface map of Response surface(X2，X3)

本研究證明將Plackett－Burman篩選與響應面分析相結合對米曲霉ASPE0485所產β－葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，效果顯著。確定顯著影響因子為碳源、接種量和表面活性劑，通過最陡爬坡及Box－Benhnken響應面實驗確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(%，w/v):玉米芯3.8%、大豆蛋白胨0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.05%、吐溫－80 0.27%和接種量5.3%;在此條件下發(fā)酵，得到酶活為21.1U/mL，比原始酶活(17.65U/mL)提高了19.55%。由此可知響應面法可快速有效且直觀的選擇實驗設計中的最優(yōu)化條件，能夠降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件，為提高產品質量、解決生產過程中的實際問題提供了一種有效方法。本文選用的響應面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基，提高了發(fā)酵水平，為發(fā)酵優(yōu)化方法提供一定的借鑒作用，為工業(yè)化發(fā)酵生產β－葡萄糖苷酶奠定了理論基礎。

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Optimization and analysis of β－glucosidase production by Aspergillus oryzae in liquid cultures using response surface methodology

ZHU Jing1，WANG Qing－yan1，2，LIU Yan－jing2，SHE Nai－kun1，CHEN Gui－guang2，LIANG Zhi－qun2，*
(1.National Engineering Research Center for Non－food Biorefinery，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530007，China; 2.Life Science and Technology College，Guangxi University，Nanning 530005，China)

Response surface analysis was conducted on Aspergillus oryzae ASPE0485 to determine the optimal culture medium for β－glucosidase fermentation.The Box－Behnken and Plackett－Burman design was utilized to the response surface analysis to determine the optimal culture medium consistents(%，w/v)were as follow:corncob 3.8%、soya peptone 0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.05%、tween－80 0.27%and inoculum size 5.3%.The β－glucosidase activity was 21.1U/mL under the optimal conditions，which was more 19.55%than the original strain activity(17.65U/mL).

Aspergillus oryzae;β－glucosidase;response surface analysis

TS201.3

A

1002－0306(2012)08－0215－04

β－葡萄糖苷酶(EC3，2，1，21)屬于水解酶系，廣泛地存在于自然界許多植物體及酵母、曲霉菌、木霉菌屬、細菌等微生物體系內。它的作用是水解結合于未端、非還原性的β－D－糖苷鍵，同時釋放β－D－葡萄糖和相應的配基。在纖維素的糖化作用中，β－葡萄糖苷酶的功能是將纖維素二糖和纖維素寡糖水解成葡萄糖［1］。β－葡萄糖苷酶是纖維素酶系的重要成員，而且由于其在纖維素酶組分中含量最少、活力普遍較低，成為纖維素酶解的主要瓶頸。因此，增強纖維素酶體系中β－葡萄糖苷酶的活力，是提高纖維素水解得率和葡萄糖產量的關鍵措施之一。米曲霉是美國食品與藥物管理局和美國飼料公司協(xié)會在1989年公布的40余種安全微生物菌種之一，已廣泛地應用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)中。本文采用響應面法(RSM)對米曲霉ASPE0485所產的β－葡萄糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，從而提高β－葡萄糖苷酶產量，為規(guī)模化生產 β－葡萄糖苷酶提供理論基礎［2－3］。

2011－07－11 *通訊聯(lián)系人

朱婧(1983－)，女，碩士研究生，研究實習員，研究方向:發(fā)酵工程。

桂科攻(09YJ17SW02);桂科攻(1099070)。