木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白水解條件的研究

高丹丹，徐紀平，李貞子

(西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030)

木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白水解條件的研究

高丹丹，徐紀平，李貞子

(西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030)

采用馬鈴薯渣為原料提取馬鈴薯蛋白，用木瓜蛋白酶對其進行水解。研究水解時間、溫度、pH和酶與底物濃度比(E/S)四個因素對水解過程的影響。以水解度(DH)為評價指標，在單因素實驗的基礎上，采用Box－Benhnken響應面分析法，優化木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白質的工藝條件。結果表明，在酶與底物濃度比為6000U/g時，最佳的水解條件為:溫度為64.70℃、pH為7.41、水解反應時間3.12h。在此條件下，水解度為20.19%。

木瓜蛋白酶，馬鈴薯蛋白質，水解度(DH)，響應面，Box－Benhnken

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯渣 甘肅省蘭州市榆中縣金芋淀粉廠提供;木瓜蛋白酶(500U/mg) 北京中生瑞泰科技有限公司;TCA、茚三酮、正丁醇、氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑 均為分析純。

FE220型中型粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司;3K18型高速冷凍離心機 德國Sigma公司; PB－10型精密pH計 Sartorius公司;GL－3250B型控溫磁力攪拌器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司; MP－500B型電子天平 上海天平總廠;Labconco Freezoneil型臺式凍干系統 照生公司;HH－SH－4型電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠;6010型紫外分光光度計 惠普有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬鈴薯蛋白的提取工藝［6］馬鈴薯渣粉20g→加600mL蒸餾水→用1mol/L的NaOH溶液調節體系的pH→浸提4h→4000r/min離心15min→分離出上清液→用1mol/L鹽酸溶液調節上清液的pH為4.5→8000r/min離心15min→得到蛋白質凝乳沉淀→冷凍干燥→馬鈴薯蛋白粉(蛋白質含量91.07%)。

1.2.2 馬鈴薯蛋白酶解液的制備［7］配制一定濃度的馬鈴薯蛋白質溶液，加氫氧化鈉或鹽酸調節pH至酶的最適pH，然后按比例加入木瓜蛋白酶，在適當的溫度條件下進行水解，95℃水浴滅酶15min，然后加入一定量的10%的TCA(三氯乙酸)，4℃條件下8000r/min離心15min，沉降酶蛋白以及未酶解的馬鈴薯蛋白質，取上清液直接使用或保存在－20℃等待分析使用。

1.2.3 水解度的測定 水解度的測定方法采用茚三酮比色法［8］。

式中:Ah為不同時間酶解液中的總游離氨基數，mmol;A1為原料蛋白強酸水解后的總游離氨基數，mmol;A0為原料蛋白中固有的游離氨基數，mmol。

1.2.4 酶解條件的單因素實驗設計 單因素實驗設計以DH(水解度)為評定指標，研究不同的酶解時間、溫度、pH和酶與底物濃度比(E/S)對木瓜蛋白酶水解效果的影響，確定各因素的最佳水平。

1.2.5 響應面實驗設計 根據單因素實驗結果，采用響應面設計實驗，運用Box－Behnken的中心組合實驗設計原理［9］，選擇對水解度具有顯著影響的三個因素:溫度(A)、pH(B)和反應時間(C)采用三因素三水平的響應面實驗設計，見表1。

表1 Box－Behnken實驗設計Table 1 Experimental design and variables levels for Box－Behnken

1.2.6 實驗數據分析 采用F檢驗對實驗數據進行方差分析以評價模型的統計意義［10］，數據分析軟件采用Design Expert 6.0。

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的單因素實驗分析

2.1.1 反應時間對水解效果的影響 在酶與底物濃度比為6000U/g、溫度為50℃、pH=7.5的條件下，每隔1h測定其水解度。水解度曲線如圖1所示，不同水解時間木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解程度不同，水解度隨時間的增加而增加，前4h水解度增加的幅度明顯，4h后，水解度增加趨勢緩慢，趨于穩定，因此認為，在工業生產中，選定最佳的酶解時間為4h。

圖1 水解時間對水解效果的影響Fig.1 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.1.2 pH對水解效果的影響 在酶與底物濃度比為6000U/g、溫度為50℃、酶解時間為4h的條件下，將反應液的pH分別調節為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，然后置于反應瓶中進行水解反應，測定其水解度。

pH對酶促反應的影響是多方面的，過酸或過堿都會使酶發生可逆性或不可逆性的失活，也可通過改變酶的空間構象而使其失活，且pH還可以改變底物的解離狀態，影響其與酶的結合［9］。每種蛋白酶都有其和底物反應的最適合pH范圍，通過實驗，由圖2可知，pH為7.5時水解度最高，因此，可確定木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的酶解反應的最適pH為7.5。

圖2 pH對水解效果的影響Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.3 溫度對水解效果的影響 在酶與底物濃度比為6000U/g、pH為7.5、酶解時間為4h的條件下，將反應物分別置于40、45、50、55、60和65℃的溫度下進行酶解反應，取酶解液測定其水解度。

不同溫度條件下的木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解度曲線如圖3所示，由圖3可知，溫度由40℃上升至55℃過程中，水解度升高，而當溫度繼續升至65℃時，水解度逐漸降低。由于溫度對酶促反應的影響包括兩方面:一方面，隨溫度的升高而使蛋白酶逐步變性，即通過減少有活性的酶而降低酶的反應速度;另一方面，當溫度升高時反應速度也加快。在高于最適溫度時，前一種效應為主，在低于最適溫度時，后一種效應為主，因而酶活性喪失，反應速度下降。因此，可確定酶解反應的最適溫度為55℃。

2.1.4 E/S對水解效果的影響 在溫度為60℃、pH 7.5、酶解時間為4h的條件下，將馬鈴薯蛋白質溶液置于E/S分別為2000、4000、6000、8000和10000U/g的反應瓶中進行酶解反應，取酶解液測定其水解度。

圖3 溫度對水解效果的影響Fig.3 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

不同E/S條件下的木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解度曲線如圖4所示，由圖4可知，隨著加酶量的增大，水解度也相應地增大。但E/S從6000U/g (包括6000U/g)往上增加時，水解度的增幅較小，從實際生產中經濟成本方面考慮，在不顯著影響水解度的情況下，加酶量應盡量減少以降低成本，因此可確定酶解反應的最適E/S為6000U/g。

圖4 酶與底物濃度比(E/S)對水解效果的影響Fig.4 Effect of the substrate/enzyme ratio on the degree of hydrolysis

2.2 木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白響應面實驗分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立與檢驗 木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的響應面分析實驗依據 Box－Behnken中心法設計了17組實驗，其中包括5組中心點重復實驗，實驗的數據結果如表2所示。

利用Design Expert 6.0軟件對表2中的實驗數據進行多元回歸擬合，得到木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的回歸方程為:Y=15.90﹢3.68A－1.13B－0.18C+0.42A2－1.38B2－3.31C2+0.25AB－2.67AC－1.69BC。

對該模型進行方差分析，結果如表3所示。由表3中數據可知，本實驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P＜0.0001)［8］。失擬項在α=0.05水平上不顯著(P=0.0953＞0.05)，說明未知因素對實驗的結果干擾小［11］，其決定系數為0.9972，校正決定系數為 0.9936，說明該二次多項模型能解釋99.36%的響應值的變化，僅僅只有總變異的0.64%不能用該二次多項模型來解釋，表明該模型的擬合度良好，用此模型可以對木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解過程進行優化。

對回歸方程的回歸系數進行顯著性檢驗，結果如表4所示。由表4中數據可知，實驗中A、B、A2、B2、C2、AC和BC這七個因素對水解度的影響顯著，表明在木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的過程中，溫度和pH對水解度有顯著的影響;且由于AC和BC顯著，說明水解的過程中，溫度和水解反應時間以及pH和水解反應時間之間的交互作用也會對水解度造成顯著影響。

表2 Box－Behnken實驗設計及實驗數據結果Table 2 Box－Behnken design matrix and the experimental results

表3 二次多項模型方差分析結果Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

表4 回歸方程系數顯著性檢驗結果Table 4 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

2.2.2 響應面分析及優化 通過上述二次多項模型方程的建立可得出一系列響應面的曲面圖，如圖5～圖7所示。通過動態圖即可對任意兩種因素的交互作用影響水解度的效應進行分析和評價，并且可以從中確定最佳因素的水平范圍。等高線的形狀可以反映出交互作用影響效應的強弱與大小，橢圓形表示兩種因素的交互作用影響顯著，而圓形則恰好與之相反，表示這兩種因素的交互作用影響不顯著［12］。

由圖5可以看出溫度與pH對水解度的交互作用的影響效應。從等高線圖可知，溫度與pH的交互作用影響不顯著。將水解時間固定在0水平時，酶解液的水解度隨著pH和溫度的升高而增加，到達最大值后開始降低，在低溫和低pH條件下，酶的活性很差。從圖5中也可以看出木瓜蛋白酶的耐高溫性比較強，當溫度高于65℃時才開始逐漸失活。

圖5 溫度與pH交互作用影響水解度的響應曲面圖Fig.5 Response surface graph of the effects of variables on the degree of hydrolysis versus temperature and pH

圖6顯示了溫度與水解反應時間對水解度的交互作用的影響效應。其等高線圖呈現橢圓形，表明溫度與水解反應時間的交互作用影響顯著。當把pH固定在0水平(pH為7.5)，響應值最大可以達到20.61%。

圖6 溫度與反應時間交互作用影響水解度的響應曲面圖Fig.6 Response surface graph of the effects of variables on the degree of hydrolysis versus temperature and time

圖7 pH與反應時間交互作用影響水解度的響應曲面圖Fig.7 Response surface graph for the effects of variables on the degree of hydrolysis versus pH and time

圖7反映了pH與水解反應時間對水解度的交互作用的影響效應。從圖7中的等高線圖及曲面圖可知，pH與水解反應時間這兩種因素對水解度的交互作用影響顯著。可見pH對響應值的影響較大，在適當的pH條件下，隨著水解時間的增加，水解度呈增大趨勢。

2.2.3 模型驗證實驗 根據Box－Behnken實驗所測得的結果以及二次多項回歸方程，再利用 Design Expert 6.0軟件可獲得本實驗水解度最高時的各因素的最佳水解條件為溫度64.70℃、pH為7.41、水解反應時間3.12h。在此水解條件下，水解度為20.45%。對此優化條件進行驗證實驗，重復進行三次，取得木瓜蛋白酶酶解馬鈴薯蛋白的水解度為 20.16%、20.08%和20.33%，平均值為20.19%，與理論計算值的誤差在±1%以內，可見該模型能較好地預測實際的水解情況。

3 結論

本研究通過單因素實驗，確定了最適加酶量為6000U/g，最適溫度為55℃，最適pH為7.5，最適水解反應時間為4h。以此為基礎，并且以水解度為最終評價指標，通過Box－Benhnken響應面分析法對木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解條件進行優化，得出最佳的水解條件為溫度64.7℃、pH為7.41、水解反應時間3.12h。在此水解條件下，水解度為20.19%。通過方差分析可知，溫度與pH對水解度的影響是顯著的，溫度和水解反應時間以及pH和水解反應時間之間的交互作用對水解度的影響也是顯著的，溫度和pH對水解度的交互作用影響是不顯著的。由此可知，響應面分析法可以有效地優化木瓜蛋白酶水解馬鈴薯蛋白的水解條件，這對馬鈴薯蛋白的開發和利用有一定的參考意義。

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Study on the optimum conditions of the hydrolyzation of potato protein by papain

GAO Dan－dan，XU Ji－ping，LI Zhen－zi
(College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China)

Potato protein was extracted from potato pulp and hydrolyzed by papain.The influences of the hydrolysis time，temperature，pH，and substrate/enzyme ratio on the degree of hydrolysis of potato protein were investigated. On the basis of single factor tests and Box－Benhnken response surface methodology，the optimal working parameters were worked out and tested.The optimum hydrolysis parameters were as follows:when the substrate/ enzyme ratio was 6000U/g，the potato protein was hydrolyzed for 3.12h at temperature 64.70℃under pH 7.41，and the degree of hydrolysis was reached 20.19%.

papain;potato protein;hydrolysis degree;response surface;Box－Benhnken

TS201.2+1

A

1002－0306(2012)08－0267－05

馬鈴薯的蛋白含量約為2%，折合成標準水分后，蛋白質含量遠遠高于小麥、水稻和玉米等糧食作物，可達到10%左右［1］。馬鈴薯蛋白含人體所必需的8種主要的氨基酸，由于其賴氨酸含量高而可與谷物蛋白營養互補，故馬鈴薯蛋白具有較高的營養價值。馬鈴薯蛋白的必需氨基酸平衡要優于其它植物蛋白，與全雞蛋和酪蛋白相當，是一種很好的食用蛋白［2］。但長期以來，馬鈴薯蛋白作為馬鈴薯淀粉生產的副產品，大部分用做肥料，只有少部分用做反芻動物飼料，沒有得到很好的開發利用，造成了蛋白質資源的極大浪費。近年來國內外學者利用不同的植物蛋白質，通過酶的水解對其改性，制備各種各樣的生物活性多肽［3］。目前，國內外比較普遍的是將大豆蛋白經蛋白酶水解并經分離、精制后得到分子量低于1000為主的低聚肽混合物［4］。但是，采用蛋白酶水解馬鈴薯蛋白，制備生物活性肽的研究還很少見，因此具有較大的研究空間。酶解可使原來蛋白質的功能特性發生很大變化，這些特性的改變很大程度上取決于水解度的大小。有研究表明，在一定時間內，產物水解度的大小和其生物活性的高低呈正相關［5］。所以，對水解工藝進行優化和控制具有十分重要的現實意義。本研究立足國內外對植物蛋白研究的熱點，以馬鈴薯渣為原料提取馬鈴薯蛋白，采用木瓜蛋白酶對其進行水解，在單因素實驗的基礎上，利用響應面分析法對水解條件進行優化，并獲得最佳的水解條件，從而為馬鈴薯蛋白的開發和利用奠定基礎。

2011－06－07

高丹丹(1983－)，女，博士，副教授，研究方向:食品生物技術。

西北民族大學中央高校基本科研業務費專項資金資助(zyz2011072);甘肅省青年科技基金計劃(1107RJYA018)。