糯米蛋白提取工藝優(yōu)化及其水解物性質(zhì)的測定

王國澤，袁懷波，徐建文

(1.內(nèi)蒙古科技大學數(shù)理與生物工程學院，內(nèi)蒙古包頭014010; 2.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥230009)

糯米蛋白提取工藝優(yōu)化及其水解物性質(zhì)的測定

王國澤1，袁懷波2，*，徐建文2

(1.內(nèi)蒙古科技大學數(shù)理與生物工程學院，內(nèi)蒙古包頭014010; 2.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥230009)

以糯米為原料，采用堿性蛋白酶水解法提取了糯米蛋白。就影響糯米蛋白提取率的5個因素:料液比(g/mL)、加酶量(E/S)、pH、溫度和提取時間進行單因素實驗和正交實驗。研究確立了提取糯米蛋白的最佳工藝條件為料液比1∶12，加酶量2%，pH 9，溫度45℃，提取時間3h。在此條件下，糯米蛋白的提取率可達8.529%。實驗表明，糯米蛋白水解物是一類天然的抗氧化氨基酸及其聚合物。

糯米蛋白，提取工藝，抗氧化性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糯米 蚌埠市兄弟糧油食品科技有限公司提供;鹽酸(0.1mo1/L)、氫氧化鈉(0.1mol/L)、無水乙醇、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇、FeSO4、H2O2、水楊酸鈉、磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)、鐵氰化鉀(1%)、三氯乙酸(10%)、三氯化鐵(0.1%)、維生素C(VC)、考馬斯亮藍G－250試劑 分析純，天津天津風船化學試劑科技有限公司;酸性蛋白酶(活力單位50000U/g)、堿性蛋白酶(活力單位100000U/g)、木瓜蛋白酶(活力單位50000U/g)、中性蛋白酶(活力單位50000U/g)及復合蛋白酶(活力單位50000U/g)天津利華酶制劑有限公司。

KA－1000型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;JA1003型電子天平 奧豪斯(上海)公司;THZ－92A型恒溫水浴鍋 江蘇金壇環(huán)宇科學儀器廠;THZ－92A型恒溫氣浴漩渦振蕩器 上海浦東物理光學儀器廠;752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;JC101型電熱鼓風干燥箱 上海成順儀器儀表有限公司;FZ102型微型植物試樣粉碎機 河北黃驊市齊家務科學儀器廠;BCD－192ACM型冰箱美的集團電冰箱制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糯米樣品制備 糯米→37℃干燥6h→磨碎過40目篩→糯米樣品。

1.2.2 糯米蛋白提取工藝 堿提取法工藝流程:糯米樣品→調(diào)pH→恒溫氣浴中堿解→離心(3000r/min，10min)→上清液→調(diào)節(jié)等電點酸沉→離心(3000r/min，10min)→沉淀→冷凍干燥→糯米蛋白。

酶法提取工藝流程:糯米樣品→加水到預定量→調(diào)節(jié)pH→加入預定量的酶→恒溫氣浴中酶解→離心(3000r/min，10min)→取上清液→滅酶→真空濃縮→冷凍干燥→糯米蛋白。

1.2.3 正交實驗設計 正交實驗優(yōu)化糯米蛋白提取工藝所選取的因素和水平見表1。

表1 L9(33)正交實驗因素和水平Table 1 Factors and levels in L9(33)orthogonal array design

1.2.4 蛋白質(zhì)提取率計算 采用考馬氏亮藍法［14］測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。

糯米蛋白提取率(%)=上清液蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)/樣品質(zhì)量(g)×100%。

1.2.5 糯米蛋白水解物抗氧化性測定 采用堿性蛋白酶提取最佳工藝制備糯米蛋白，再利用木瓜蛋白酶在pH=7，溫度60℃條件下對所制備的糯米蛋白進行酶解制備糯米蛋白水解物，測定糯米蛋白水解物的DPPH自由基［15］和羥自由基清除能力及其還原能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種蛋白酶與堿法提取糯米蛋白的比較

設定料液比1∶10、加酶量2%，調(diào)節(jié)酸性蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶在各自最適溫度和pH對糯米蛋白進行水解，對比四種蛋白酶與最優(yōu)工藝條件下堿法提取糯米蛋白的提取率，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，酸性蛋白酶的提取率僅為1.940%;中性蛋白酶提取率與復合蛋白酶提取率為5.500%左右，相差不大，堿法提取率較高為7.132%，而堿性蛋白酶提取率為7.834%。通過比較可知堿性蛋白酶是進行糯米蛋白提取實驗最佳選擇。

圖1 糯米蛋白提取率的比較Fig.1 The comparison on extraction rate of sticky rice protein

2.2 堿性蛋白酶提取糯米蛋白的單因素分析

2.2.1 pH對糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進行實驗，分別考察pH為8、9、10、11和12時的提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 pH對糯米蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of pH on extraction rate of sticky rice protein

由圖2可以看出，在pH 8～10范圍內(nèi)，隨著pH的升高，糯米蛋白的提取率升高，當pH為10時，達到峰值;隨后再隨pH升高，提取率反而下降，且樣品液顏色變深。這一結(jié)果與堿性蛋白酶的最適pH范圍相吻合［18］。

糯米蛋白質(zhì)中含有較多的二硫鍵，堿液可以使糯米蛋白質(zhì)緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，同時堿液對蛋白質(zhì)分子的次級鍵特別是氫鍵具有破壞作用，并可使某些極性基團發(fā)生解離，使蛋白質(zhì)分子表面的分子具有相同電荷，從而對蛋白質(zhì)分子有增溶作用，這種增溶作用隨堿性強度的增加而增大;但再度提高pH，會造成蛋白質(zhì)過度水解，提取率降低，同時氨基酸間有可能發(fā)生縮合反應，生成賴氨酰丙氨酸等有害身體健康的物質(zhì)［19］。從圖2中看出，pH=9與pH=10的提取率相差不大，從保護蛋白質(zhì)特性角度選擇pH =9為最佳。

2.2.2 溫度對糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進行實驗，分別考察溫度為25、35、45、55和65℃時的提取率。結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，堿性蛋白酶水解糯米蛋白的提取率隨溫度升高逐漸增大，但在溫度達到45℃左右后，提取率不再增大，溫度繼續(xù)上升，提取率反而減小。這是由于一定范圍內(nèi)溫度的升高，可以增加反應的活化分子數(shù)，反應速率增大。當達到最適溫度后，繼續(xù)升溫，會導致酶及蛋白質(zhì)的變性失活，提取率降低［20］。所以45℃是堿性蛋白酶的最適作用溫度。

2.2.3 料液比對糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進行實驗，分別考察料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和1∶14時的提取率，結(jié)果見圖4。

圖3 溫度對糯米蛋白提取率的影響Fig.3 The effect of temperature on extraction rate of sticky rice protein

圖4 料液比對糯米蛋白提取率的影響Fig.4 The effect of solid to liquid ratio on extraction rate of sticky rice protein

由圖4可知，隨著料液比的增加，糯米蛋白的提取率開始變大，且上升速度比較快，在1∶6的料液比下，溶液的粘度較大。分子擴散速率低，導致體系分散不均勻，并且可能導致局部的pH過高，酶活性降低［21］。隨著料液比的增大，堿性蛋白酶水解糯米蛋白的提取率逐漸增大，在料液比達到1∶10之后，趨于平緩，且略有下降，1∶10是糯米蛋白提取實驗的最佳料液比。

2.2.4 加酶量對糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進行實驗，分別考察加酶量(E/S)為1%、1.5%、2%、2.5%和3%時的提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 酶用量對糯米蛋白提取率的影響Fig.5 The effect of enzyme dosage on extraction rate of sticky rice protein

從圖5可以看出，糯米蛋白的提取率隨加酶量的增加而增大，但當加酶量(E/S)超過2%之后，提取率趨于平穩(wěn)。這是因為在底物濃度一定的情況下，反應速率與酶濃度成正比例關(guān)系［20］。當加酶量(E/S)為2%時，蛋白質(zhì)的提取率最高。再提高加酶量時，蛋白質(zhì)過度水解，提取率下降。所以選取加酶量(E/S)為2%。

2.2.5 反應時間對糯米蛋白提取率的影響 按照1.2.2中酶法提取工藝流程進行實驗，分別考察時間為2、3、4、5和6h的提取率，結(jié)果見圖6。

圖6 時間對糯米蛋白提取率的影響Fig.6 The effect of time on extraction rate of sticky rice protein

由圖6可見，隨著反應時間的延長，堿性蛋白酶對糯米蛋白的提取率逐漸增大，但當時間大于3h后，提取率的變化趨勢不明顯，所以選取提取時間為3h。

2.3 堿性蛋白酶提取糯米蛋白最佳工藝的確定

在以上單因素的基礎上，進行單因素方差分析，結(jié)果如表2所示，根據(jù)單因素的顯著性選取了對糯米蛋白提取率的料液比、溫度和加酶量顯著的三個因素，按L9(33)進行正交實驗，正交實驗結(jié)果見表3。

表2 單因素方差分析Table 2 Single factor analysis of variance

表3 L9(33)正交實驗結(jié)果及分析Table 3 Results of L9(33)orthogonal array design experiments and range analysis for SDF yield

根據(jù)正交實驗結(jié)果，可知正交實驗設定的三因素對提取率的影響大小次序為:A＞B＞C。堿性蛋白酶水解糯米蛋白的最佳反應條件為A2B3C2，即溫度45℃、料液比1∶12、加酶量(E/S)2%，pH=9和水解時間3h。在此條件下進行驗證實驗，并重復三次。糯米蛋白平均提取率為8.529%。

2.4 糯米蛋白水解物抗氧化實驗結(jié)果

2.4.1 糯米蛋白水解物清除DPPH自由基的效果分析 由圖7可見，糯米蛋白水解物和VC均有清除DPPH自由基的能力。糯米蛋白水解物隨著濃度的增大，清除DPPH自由基的能力呈增大的趨勢，在糯米蛋白水解物濃度為1.0mg/mL時，其清除率約為60.00%。VC對DPPH的清除率雖然也隨著濃度的增大而增大，但其增幅不大，清除率基本保持在7.00%左右。通過比較可得，糯米蛋白水解物比VC具有更強地清除DPPH的能力。

圖7 糯米蛋白水解物和VC對DPPH自由基的清除能力Fig.7 Concentration dependence of scavenging rate of hydrolyzate from sticky rice protein and VCagainst DPPH free radicals

2.4.2 糯米蛋白水解物清除羥自由基的效果分析由圖8可見，糯米蛋白水解物和VC均有清除羥自由基的能力。隨著糯米蛋白水解物濃度的增大，其對羥自由基的清除能力呈增大的趨勢，在0.2～1.0mg/mL的濃度下，其對羥自由基的清除率基本保持在35%～50%的范圍內(nèi)緩慢均勻增加。而VC在0.2～0.8mg/mL的條件下，隨著濃度的增大，其對羥自由基的清除率增大，清除率最高達到 69.00%。當 VC濃度高于0.8mg/mL時，其對羥自由基的清除率反而下降。

圖8 糯米蛋白水解物和VC對羥自由基的清除作用Fig.8 Concentration dependence of scavenging rate of hydrolyzate from sticky rice protein and VCagainst hydroxyl free radicals

2.4.3 糯米蛋白水解物的還原能力分析 在還原能力分析中，反應產(chǎn)物在700nm中的吸光值越大，表明樣品的還原能力越大。從圖9可見，糯米蛋白水解物和VC均表現(xiàn)出較強的還原能力。在糯米蛋白水解物和VC濃度為0.2～0.6mg/mL時，它們的還原能力基本保持不變;當濃度超過0.6mg/mL后，它們的還原能力顯著增強。而且在相同濃度下，糯米蛋白水解物的還原能力比VC強。

圖9 糯米蛋白水解物和VC的還原能力Fig.9 Concentration dependence of reducing power of hydrolyzate from sticky rice protein and VC

3 結(jié)論

通過四種蛋白酶和堿法提取糯米蛋白提取率的比較，得出堿性蛋白酶是提取糯米蛋白的最佳選擇。通過單因素實驗和正交實驗結(jié)果分析得出，堿性蛋白酶提取糯米蛋白的最佳工藝條件為:料液比1∶12、加酶量(E/S)2%、溫度45℃、pH=9、水解時間3h。在此條件下糯米蛋白提取率可達8.529%。抗氧化活性實驗結(jié)果表明，糯米蛋白水解物具有一定的清除DPPH自由基和羥自由基的能力，且具有較強的還原能力，因此本研究得到的糯米蛋白水解物是一類天然的抗氧化氨基酸及其聚合物。

［1］王立，陳正行，姚惠源.酶法提取米糠蛋白質(zhì)的研究［J］.糧食與油脂，2002(4):12－13.

［2］王文高，陳正行，姚惠源.不同蛋白酶提取大米蛋白質(zhì)的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2002(2):41－42.

［3］Frederick F Shih.Use of enzymes for the separation of protein from rice flour［J］.Cereal Chemistry，1997，74(4):437－441.

［4］Ravin Gnanasambandam.Protein concentrate from unstabilized and stabilized rice bran:Reparation and properties［J］.J of Food Science，1995，60(5):1066－1069.

［5］M Wang.Preparation and functional properties of rice bran protein isolate［J］.Agri Food Chem，1999，47:411－416.

［6］金世合，陳正行.米糠蛋白提取和功能性質(zhì)研究［J］.糧食與油脂，2003(6):21－22.

［7］周鳳超，王藤宇，關(guān)海寧，等.米糠蛋白的提取及應用現(xiàn)狀［J］.糧油加工，2010(1):55－56.

［8］李桂菊，王曉強，何啟剛，等.堿溶時間對大豆蛋白提取率和得率的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39(4):2292－2293，2296.

［9］宋鵬，魏安池，周瑞寶，等.不同工藝條件對大豆分離蛋白提取率的影響［J］.中國油脂，2011，36(2):16－19.

［10］吳英華，向開祥.秈碎米中大米蛋白提取工藝研究［J］.應用化工，2011，39(11):1167－1169.

［11］吳思.大米蛋白提取與酶解條件研究［J］.天津職業(yè)院校聯(lián)合學報，2010，5(12):30－33.

［12］吳英華，任鳳蓮.大米蛋白提取工藝的研究及產(chǎn)品開發(fā)［J］.糧油工程，2011(11):71－74.

［13］錢俊青，羅旭.酶解改良米蛋白熱凝固性的研究［J］.浙江工業(yè)大學學報，2011，39(1):14－15.

［14］樂萍，雷頡，熊建銘.蛋白質(zhì)測定方法比較與研究進展［J］.江西化工，2007(2):50－52.

［15］陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.香椿葉提取物清除DPPH自由基能力的測定方法［J］.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2006，26(3): 70－73.

［16］Chung H L，Lin Y，Jin Z X，et al.Relative antioxidant activity of soybean isoflavones and their glycosides［J］.Food Chemistry，2005，90:735－741.

［17］Lin Chunmao，Xin Pan，F(xiàn)ei Que，et al.Antioxidant properties of water and ethanol extracts from hot air－dried and freeze－dried daylily flowers［J］.European Food Research and Technology，2006，222(3/4):237－241.

［18］陳季旺，姚惠源，張小勇，等.米糠可溶性蛋白的提取工藝和特性研究［J］.中國油脂，2003，28(2):46－50.

［19］Anshamllah，James A Hourigan，Colin F Chesterman. Application of carbohydrases in extracting protein from rice bran［J］.Journal of Seience Food Agrieulture，1997，74:141－146.

［20］葛娜，易翠平，姚惠源.酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究［J］.食品與機械，2006，22(1):53－55.

［21］陳義勇，王偉，沈宗根，等.米糠可溶性蛋白提取工藝中各因素影響的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22(4):64－65.

Optimization of alkaline protease extraction of sticky rice protein from sticky rice and properties mensuration of hydrolysates of sticky rice protein

WANG Guo－ze1，YUAN Huai－bo2，*，XU Jian－wen2
(1.School of Mathematical Physics and Biology Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，China; 2.School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)

In order to obtain the extraction of sticky rice protein，sticky rice was used as raw materials by alkaline protease.The influence factors，amount of solid to liquid ratio，enzyme dosage，pH，temperature and time of the alkaline protease，which could affect the efficiency of extracting sticky rice protein，were investigated by singlefactor experiment and orthogonal test.The research results showed that the optimal technical parameters could be obtained as following:solid to liquid ratio 1∶12，enzyme dosage 2%，pH=9，temperature 45℃and time 3h.The max extraction rate of sticky rice protein reached to 8.529%.Antioxidant tests of protein hydrolysates by papain showed that hydrolyzate from sticky rice protein serves as amino acids or their polymer.

sticky rice protein;extraction;antioxidant

TS201.1

B

1002－0306(2012)08－0259－05

糯米蛋白是一種營養(yǎng)價值極高的蛋白質(zhì)，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白和谷蛋白四種蛋白組成，它的氨基酸組成平衡合理，且含量較高，是被公認為優(yōu)質(zhì)的食品蛋白。糯米蛋白的生物價很高，其營養(yǎng)價值可與魚、雞蛋、牛乳、牛肉等相媲美［1－2］。此外，糯米蛋白是抵抗原蛋白，不會產(chǎn)生過敏反應，在生產(chǎn)嬰幼兒食品方面有著廣泛應用。糯米蛋白不僅具有獨特的營養(yǎng)功能，同時還具有降低血清中膽固醇含量等保健功能［3－5］。目前提取蛋白的方法主要有物理提取、堿法提取和酶法提取。物理提取是通過破碎細胞結(jié)構(gòu)而獲取蛋白的方法，其提取率低，設備投資較高［6－7］。堿法提取簡便易行，但在堿液濃度過高情況下，會影響產(chǎn)品風味和色澤，同時會產(chǎn)生不利反應，并會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)特性［8－10］。酶法提取反應條件溫和，不會產(chǎn)生有害物質(zhì)，而且能更多保留蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值［11－13］。本文以糯米為原料，采用堿性蛋白酶水解法制備糯米蛋白，以糯米蛋白的提取率為評價指標，確定各因素的最佳提取條件，以提高糯米蛋白的產(chǎn)率，從而提高糯米的經(jīng)濟價值。

2011－07－06 *通訊聯(lián)系人

王國澤(1975－)，女，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏方面的研究。

教育部春暉計劃合作科研項目(Z2009－1－01039);內(nèi)蒙古科技大學創(chuàng)新基金項目(2009NC060)。