DPPH自由基清除活性評價(jià)方法在抗氧化劑篩選中的研究進(jìn)展

熊雙麗，盧 飛，史敏娟，吳照民

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010; 2.西南科技大學(xué)食品科學(xué)研究所，四川綿陽621010)

DPPH自由基清除活性評價(jià)方法在抗氧化劑篩選中的研究進(jìn)展

熊雙麗1，2，盧 飛1，史敏娟1，吳照民1，2

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010; 2.西南科技大學(xué)食品科學(xué)研究所，四川綿陽621010)

1，1－二苯基－2－苦基肼(1，1－Diphenyl－2－picryl－h(huán)ydrazyl，DPPH)自由基是合成的以氮為中心的穩(wěn)定自由基，結(jié)構(gòu)簡單，反應(yīng)容易控制，已廣泛應(yīng)用于各種物質(zhì)提取物或純化合物的抗氧化活性的評價(jià)和篩選。論文詳述了目前國內(nèi)外DPPH自由基應(yīng)用于抗氧化劑的抗氧化活性評價(jià)的測定方法(分光光度法、電子順磁共振法、電化學(xué)法和反相高效液相液色譜法)、原理，以及應(yīng)用特性。

DPPH自由基，抗氧化，原理，應(yīng)用

1 分光光度法測定抗氧化劑的DPPH自由基清除活性

1.1 抗氧化劑的DPPH自由基清除原理

DPPH自由基有機(jī)溶液呈紫色，在波長為517nm波長處具有最大光吸收。DPPH－比色法主要利用自由基清除劑提供一個(gè)電子與DPPH自由基的孤對電子配對(圖1)，使自身紫色變?yōu)辄S色，在517nm波長處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系，即自由基清除劑的清除能力越強(qiáng)，吸光度越小。

圖1 DPPH自由基結(jié)構(gòu)及其與自由基清除劑相互作用原理Fig.1 DPPH chemical structure and its reaction with a scavenger，indicated by A－H

1.2 各種因素對抗氧化劑DPPH－分光光度法測定的影響

DPPH－比色法僅需要分光光度計(jì)，簡單、方便，實(shí)驗(yàn)條件容易滿足，適合于大量樣品的篩選，但其容易受諸多因素影響，如有機(jī)酸、表面活性劑、無機(jī)鹽、緩沖液，以及樣品本身顏色，造成DPPH自由基清除率評價(jià)的差異。

1.2.1 有機(jī)酸對抗氧化劑DPPH自由基清除活性的影響 大部分果蔬中存在有機(jī)酸、維生素C、多酚類化合物等，絕大部分研究者在研究果蔬中維生素和多酚類化合物的抗氧化活性時(shí)，并沒有注意有機(jī)酸的影響。一般情況下，也就是純有機(jī)酸的情況下，有機(jī)酸(乙酸、檸檬酸和蘋果酸)無DPPH自由基清除活性。但是，它們與其它抗氧化劑混合后便會影響它們的DPPH自由基清除效率。Roberto Scalzozo在評價(jià)乙酸、檸檬酸和蘋果酸對維生素C的自由基清除效果影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在沒有維生素C時(shí)，三種有機(jī)酸不會引起DPPH自由基結(jié)構(gòu)變化，沒有任何自由基清除作用，但與維生素C混合后，它們都顯著增加維生素C的自由基清除效果，并呈現(xiàn)劑量依賴性［7］。因此，在評價(jià)果蔬中抗氧化劑的自由基清除效果時(shí)，須考慮其它成分的影響。

1.2.2 無機(jī)鹽和緩沖液對抗氧化劑DPPH自由基清除活性的影響 AI－Dabbas等［8］研究了25種無機(jī)鹽、兩種緩沖液對DPPH自由基的清除效果，以及它們對丁基羥基甲苯(BHT)、兒茶酚和varthemia自由基清除率的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫代硫酸鈉和氯化亞鐵在10ug/mL時(shí)，DPPH自由基清除率分別為65.3%和47.70%。當(dāng)濃度超過5ug/mL時(shí)，硫代硫酸鈉對DPPH自由基的清除率不再繼續(xù)增加，而碘、碘化鉀、偏重亞硫酸鉀和鐵氰化鉀對DPPH自由基的清除率較弱。磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氟化鉀、溴化鉀、硝酸鉀、碳酸鈣、氯化鈉等在濃度為1～400ug/mL時(shí)，都不影響DPPH自由基顏色變化，沒表現(xiàn)出自由基清除活性，但是，氯化鎂、亞硫酸鉀和硫酸鉀卻增加了DPPH自由基的顏色，表現(xiàn)出輕微的促氧化特性。在0.01～0.2mmol/L濃度范圍內(nèi)，乙酸緩沖液無DPPH自由基清除活性，而磷酸鹽緩沖液卻增加DPPH自由基顏色，表現(xiàn)出輕微的促氧化特性。磷酸氫二鉀和碳酸鉀本身無DPPH自由基清除活性，與BHT混合后，卻顯著增加BHT的DPPH自由基清除活性。因此，不同鹽溶液或緩沖液顯著影響眾多植物和動物提取物的自由基清除活性評價(jià)效果。

1.2.3 表面活性劑對抗氧化劑DPPH自由基清除活性的影響 Al－Dabbas等［9］研究了陽離子型、非離子型、陰離子型表面活性劑，以及混合表面活性劑對蘆丁DPPH自由基清除活性的影響，發(fā)現(xiàn)它們對DPPH和蘆丁溶解性影響大小依次為陽離子型、非離子型和陰離子型表面活性劑。離子型表面活性劑對蘆丁DPPH自由基清除活性的提高程度大于非離子型表面活性劑，陽離子－陰離子表面活性劑混合物優(yōu)于任意單一表面活性劑，而陰離子－非離子型表面活性劑混合物介于純陰離子和非離子表面活性劑之間。表面活性劑對蘆丁DPPH自由基清除活性的影響可能歸結(jié)為它們的結(jié)構(gòu)差異，通過與蘆丁的靜電相互作用或氫鍵相互作用等，形成不同的結(jié)構(gòu)體系。因此，食品、化妝品和藥品都含有大量的表面活性劑，在評價(jià)其活性成分時(shí)，需考慮各類乳化劑對其活性成分的影響。

并不是所有抗氧化劑的DPPH自由基清除活性都能用比色法來測定，如該法不能準(zhǔn)確測定4－硝基－2－苯氧甲烷磺酰苯胺、對位氨基雙苯砜和阿司匹林等藥物的抗氧化活性。近年來，相繼采用高效液相色譜、化學(xué)發(fā)光法、電子順磁共振法和電化學(xué)方法測定抗氧化劑的DPPH自由基清除活性。

2 電子順磁共振技術(shù)測定抗氧化劑對DPPH自由基的清除活性

電子順磁共振(Electron Paramagnetic Resonance，EPR)是直接檢測和研究含有未成對電子的順磁性物質(zhì)現(xiàn)代分析方法，具有簡單、靈敏度高、樣品不受破壞和無干擾等優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測自由基最直接、最有效的方法之一，適用于抗氧化劑自由基增抑能力的研究［10－11］。由于DPPH自由基是穩(wěn)定的順磁化合物，適合于EPR檢測，尤其是某些物質(zhì)在517nm有強(qiáng)吸收的時(shí)候，更應(yīng)該選擇DPPH－EPR法檢測抗氧化劑的自由基清除活性。例如，類胡蘿卜素，在517nm存在有強(qiáng)吸收，干擾吸光值的測定，不能采用分光光度法測定，EPR便成為其理想的檢測手段。該法直接測定自由基濃度，顯著提高分析的準(zhǔn)確性［6］。

3 電化學(xué)方法測定抗氧化劑對DPPH自由基的清除活性

電化學(xué)是研究電和化學(xué)反應(yīng)相互關(guān)系的科學(xué)。電化學(xué)分析法具有儀器簡單、操作方便、分析速度快等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥品、食品、生化制品，以及材料等的分析檢測。Ruzi等利用生物傳感器測定丁羥基茴香醚(BHA)的抗氧化特性，建立了電化學(xué)法測定抗氧化劑自由基清除活性的方法［12］。Chevion等利用低分子化合物的還原特性，采用循環(huán)伏安法(CV)測定血漿低分子化合物的抗氧化特性［13］。該法簡單、靈敏、重復(fù)性強(qiáng)，血漿樣品6個(gè)月內(nèi)測定值一致。對于標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑抗壞血酸和尿酸的自由基清除值，其檢測結(jié)果與HPLC－電化學(xué)分析一致。在此基礎(chǔ)上，Milardovic'等發(fā)展了電化學(xué)安培檢測法和循環(huán)伏安法測定抗氧化劑的DPPH自由基清除特性。兩者均采用標(biāo)準(zhǔn)三電極電化學(xué)電池，工作電極和輔助電極都為電極玻璃碳電極，Hg2Cl2|3mol/L KCl電極為參比電極。循環(huán)伏安測定中峰電流為20mV/s。該法適合于評價(jià)水溶性或醇溶性的純化合物、茶溶液、酒，以及橘子汁等飲料。測定結(jié)果與分光光度法測定結(jié)果高度相關(guān)(Trolox等值抗氧化活性，R2=0.9993)［5］。由于經(jīng)典分光光度法測定易受樣品顏色和濁度影響，需要進(jìn)行樣品的預(yù)處理，增加測定程序。碳電極安培檢測法具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，并且樣品顏色與濁度不影響檢測器的反應(yīng)，提高了檢測的準(zhǔn)確性。

表1 評價(jià)抗氧化劑DPPH自由基清除效率的指標(biāo)及特性Table 1 Index and property about evaluating DPPH free radical－scavenging activity of antioxidant

4 高效液相色潽法測定抗氧化劑對DPPH自由基的清除活性

高效液相色潽法(HPLC)具有快速、分離效率高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。通過配備不同檢測器，它已廣泛應(yīng)用于生物制品、藥品、化學(xué)品、食品等的分離分析。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已將HPLC法引入自由基的測定，提高了分析的效率和準(zhǔn)確性等［14］。Yamaguchi等采用DPPH－HPLC評價(jià)各類公認(rèn)抗氧化劑和商業(yè)飲料，并與經(jīng)典比色法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn) DPPHHPLC法測定簡便快速，不受影響顏色影響，適合于有色食品如咖啡、紅酒、橙汁等液體物質(zhì)的自由基清除活性測定［15］。此后，該法已應(yīng)用于粗提物和藥物抗氧化劑的測定［16］。Chandrasekar等采用RP－HPLC測定中藥制劑的抗氧化活性，以甲醇和水的混合物(甲醇∶水=80∶20，V∶V)為流動相，流速1mL/min，DPPH吸收峰于517nm處檢測，計(jì)算其IC50。并用已知抗氧化劑抗壞血酸、6－羥基－2，5，7，8－四甲基苯并二氫吡喃－2－羧酸(trolox)、普羅布考和α－生育酚進(jìn)行校正。DPPH－HPLC與DPPH－比色法測定上述公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑時(shí)，結(jié)果具有較高的相關(guān)性，前者通過反相C18進(jìn)行分離DPPH自由基，再進(jìn)行吸光值的測定，消除了樣品顏色和自身光吸收的影響。其準(zhǔn)確性、精確性高，重復(fù)性高于后者，而且簡單方便［3］。DPPH－HPLC的測定值顯著小于DPPH－比色法，而且重復(fù)性強(qiáng)，這可能是因?yàn)橹兴幹苿┲械母鞣N成分顏色和濃度等干擾DPPH的顏色，影響比色測定值。DPPH－HPLC法中DPPH自由基經(jīng)過HPLC分離后再進(jìn)行檢測，不受其它物質(zhì)干擾，準(zhǔn)確性增加，可以用來測定植物提取物、食品、藥物，以及中藥制劑的抗氧化活性評價(jià)和篩選。因此，與DPPH－EPR法和DPPH－電化學(xué)法相比，DPPH－HPLC操作原理、方法和圖譜分析簡單，而且儀器和色譜柱容易獲得，是次之于分光光度法的一種簡易測定方法。

5 DPPH自由基清除效率評價(jià)指標(biāo)

評價(jià)和比較各類抗氧化劑DPPH自由基清除活性的指標(biāo)包括DPPH自由基清除率、半數(shù)抑制濃度(IC50)、抗氧化劑活性指數(shù)、Trolox等值抗氧化活性、抗壞血酸等值抗氧化活性等，常見指標(biāo)及特性如表1。

6 結(jié)論

DPPH自由基結(jié)構(gòu)簡單、性質(zhì)穩(wěn)定、反應(yīng)容易控制，是未來抗氧化劑自由基清除活性篩選的首選試劑。經(jīng)典分光光度法與新發(fā)展的高效分析分離法(電子順磁共振法、電化學(xué)法和高效液相液色譜法)相比，簡便、快速，不受昂貴儀器限制，適合于一般企業(yè)和研究單位進(jìn)行大批量的抗氧化劑篩選或檢測。但是，該法容易受樣品顏色和濃度、DPPH濃度，以及反應(yīng)條件等影響，以后的研究必須考慮各類影響因素，建立標(biāo)準(zhǔn)的DPPH－分光光度檢測法和完善的評價(jià)指標(biāo)。電子順磁共振法、電化學(xué)法和高效液相液色譜法檢測快速、簡單、準(zhǔn)確性和精確性高，重復(fù)性強(qiáng)，干擾少，適合于抗氧化劑自由基清除效果的精細(xì)測定。然而這些方法對DPPH自由基的測定還不夠成熟，以后須考慮各類抗氧化劑的特性和DPPH自由基反應(yīng)特性等，研究不同測定參數(shù)對測定值的影響，建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法和評價(jià)指標(biāo)。

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Advanement of evaluation methods about DPPH radical scavenging activity in Screening Antioxidant

XIONG Shuang－li1，2，LU Fei1，SHI Min－juan1，WU Zhao－min1，2
(1.School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China; 2.Institute of Food Science，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China)

1，1－Diphenyl－2－picryl－h(huán)ydrazyl(DPPH)was a stable free radical which was synthesized and had an unpaired valence electron at one atom of nitrogen bridge.It had been extensively applied in screening and evaluation of antioxidants in various biomass because its structure was simple and the reaction of it was easy to control.This article elaborated assay methods(spectrophotometry，electron paramagnetic resonance，electrochemistry and HPLC)，principles and application properties about DPPH scavenging capacity of various antioxidants.

DPPH radical;antioxidation;principle;application

TS202.3

A

1002－0306(2012)08－0380－04

自由基生物學(xué)和自由基醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展表明，自由基與癌癥、衰老、各種心血管疾病、帕金森綜合癥等各種急性和慢性疾病密切相關(guān)［1］。與此同時(shí)，具有自由基清除活性的合成或天然抗氧化劑已成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、食品和材料等學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。評價(jià)和篩選自由基清除劑的方法包括體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大量抗氧化劑的篩選。絕大部分研究集中于體外模擬測定，主要包括DPPH自由基、羥基自由基、超氧自由基，以及氮自由基等［2］。DPPH自由基是一種合成的、具有單電子、穩(wěn)定的、以氮為中心的順磁化合物。當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，DPPH自由基接受一個(gè)電子或氫原子，形成穩(wěn)定的DPPH－H化合物，使其甲醇(或乙醇)溶液從深紫色變?yōu)辄S色，變色程度與其接受的電子數(shù)量(自由基清除活性)成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析(見圖1)。由于DPPH自由基結(jié)構(gòu)簡單，反應(yīng)容易控制，已廣泛應(yīng)用于動植物提取物或者單一化合物的抗氧化特性評價(jià)。但是，分光光度法測定抗氧化劑DPPH自由基清除活性方法，易受DPPH濃度、反應(yīng)時(shí)間、光照強(qiáng)度、pH，以及反應(yīng)溶劑等因素影響，造成同一物質(zhì)在不同的研究條件下具有不同的抗氧化活性，標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑抗壞血酸和二丁基羥基甲苯等也不例外［3－4］。因此，近年來發(fā)展了更為準(zhǔn)確的高效液相色譜、化學(xué)發(fā)光法、電子順磁共振法和電化學(xué)方法進(jìn)行DPPH自由基清除活性檢測［5－7］。本文主要?dú)w納總結(jié)了國內(nèi)外最新的DPPH自由基測定方法、原理與應(yīng)用特性，為廣大研究者提供一定參考。

2011－09－20

熊雙麗(1977－)，女，博士，副教授，研究方向:天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

西南科技大學(xué)博士基金項(xiàng)目(06zx7122);綿陽市科技局項(xiàng)目(10Y004－1)。