基于混料實驗設計優化魷魚甲醛復合抑制劑

苗林林，朱軍莉，勵建榮

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江杭州310035)

基于混料實驗設計優化魷魚甲醛復合抑制劑

苗林林，朱軍莉*，勵建榮*

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江杭州310035)

為了研發水產品內源性甲醛的控制新技術，本文利用SAS軟件的單純型格子混料設計進行秘魯魷魚甲醛復合抑制劑的優化。確定了茶多酚、氯化鈣和氯化鎂三種甲醛抑制劑的最佳配比為0.026%、0.642mmol/L、0.332mmol/L。通過模型的建立得到響應值與三種物質配比之間的回歸方程，其中茶多酚對魷魚甲醛的減少率影響最大，而氯化鈣對二甲胺的減少率影響最大。方差分析和驗證結果表明，該模型能夠準確可靠的預測響應值，并且甲醛抑制劑在高溫及pH6.0時能有效降低魷魚中甲醛和二甲胺含量。因此，該復合抑制劑可用于魷魚制品高溫加工過程中內源性甲醛生成的控制。

混料設計，甲醛，抑制劑，魷魚

混料問題是近三十年來新發展起來的十分活躍的統計分支，自1955年Claringbold［1］提出到目前為止，許多統計學家建立了適合于不同數據結構或各種統計目的所需要的混料模型，包括單純形格子混料設計［2］、單純形重心設計等多項式混料模型［3］。單純形格子設計又稱單形點陣設計，其特點是實驗點可以取在正規單純形的格子點上，保證了實驗點分布均勻且計算簡單、準確，回歸系數只是相應格子點響應值的簡單函數。因設計模型較簡單、設計方便，被廣泛應用在果凍、果茶、糕點配料等食品工業領域［4］。近年來水產品安全日益受到關注，特別是魷魚等大宗水產品所面臨的甲醛含量嚴重超標問題。甲醛為較高毒的物質，已經被世界衛生組織確定為致癌和致畸形物質，在我國有毒化學品優先控制名單上高居第二位［5］。水產品甲醛問題不僅嚴重影響了魷魚等水產品加工行業的發展，而且對食用安全也提出了挑戰。因此，研發水產品中甲醛的控制關鍵技術，提高質量和食用安全性，已成為迫切之需。目前，研究學者在水產品內源性甲醛的控制方面進行了初步探索，Herrera等［6］研究發現在凍藏的藍鱈魚糜中加入麥芽糊精和蔗糖能顯著抑制甲醛的產生; Racicot［7］報道H2O2能有效降低紅鱈魚糜中甲醛和二甲胺的含量;植酸和醋酸對秘魯魷魚氧化三甲胺酶活性有抑制作用［8］。然而，目前仍無可應用于水產品加工的甲醛控制技術。本課題組在降低魷魚甲醛含量積累了一定的工作基礎，俞其林［9］首次將茶多酚作為捕獲劑成功應用于魷魚制品，將甲醛含量降低到安全限量以下。然而，較高濃度茶多酚應用對魷魚制品的色澤有較大影響，并且產品貨架期中甲醛仍有增加的趨勢。為此，課題組進一步篩選和優化了一系列的甲醛生成抑制劑［10］。本研究基于混料實驗設計原理，將茶多酚、鈣鹽和鎂鹽三種顯著抑制秘魯魷魚中甲醛形成物質進行復合，并驗證其效果，進一步分析該復合甲醛抑制劑的作用條件，為獲得一種高效、低廉的復合甲醛抑制劑奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秘魯魷魚 浙江興業集團有限公司;茶多酚浙江大學茶葉研究所，純度98%;對甲苯磺酰氯 分析純，國藥集團試劑有限公司;二甲胺鹽酸鹽 分析純，Sigma公司;氯化鈣、氯化鎂、甲苯、氫氧化鉀、2，4－二硝基苯肼 分析純，上海化學試劑公司;甲醛標準溶液 分析純，國家環保總局;甲醇 色譜純，TEDIA公司。

Agilent GC6890氣相色譜 配有 FID檢測器，Agilent公司;Agilent HPLC1100高效液相色譜儀 配有Agilent ODS2－C18柱及紫外檢測器，美國安捷倫科技公司;高速冷凍離心機 Sigma公司;漩渦混合器 太倉市科教器材廠;AR2140電子天平 美國Ohaus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魷魚上清提取 將冷凍魷魚在室溫下解凍，去皮，去除魷魚胴體薄薄的一層表層和內層，將魚肉切片，在勻漿機中勻漿。稱取5g樣品，加入2倍的Tris－乙酸緩沖液(pH7.0)勻漿(W/V)，4℃下，5000r/min離心20min，取上清液4℃儲藏備用。

1.2.2 甲醛檢測方法 根據本實驗建立的方法［11］略有改進，利用高效液相色譜法測定甲醛含量，甲醛與2，4－二硝基苯肼于60℃水浴衍生化生成2，4－二硝基苯腙，經 ODS－C18柱分離，紫外檢測器于波長355nm下檢測，以保留時間定性，峰面積定量，間接測出甲醛含量。測定時取 1mL樣品溶液，加入DNPH衍生劑0.5mL，60℃下衍生15min，流水冷卻，0.45μm濾膜過濾后，取20μL進樣檢測。

1.2.3 二甲胺檢測方法 二甲胺測定方法采用賈佳建立的氣相色譜法［12］，取2mL三氯乙酸提取液，定容到5mL，加入2mL 65%KOH，對甲苯磺酰氯－甲苯溶液2mL，60℃水浴加熱1h，取出冷卻后振蕩3min，然后進行GC－FID分析。

1.2.4 混料實驗設計［13］對3個作用物質選用10組不同配比的實驗，以甲醛和二甲胺的減少率為影響因素，考察各物質的主效應和交互作用。具體為取魷魚上清液10mL置于具塞比色管中，按照一定濃度添加復合甲醛抑制劑溶液5mL，蓋上塞子置于100℃水浴鍋中加熱5min，取出流水冷卻，加入1mL 7.5%三氯乙酸，待檢。

1.2.5 驗證實驗 根據優化實驗設計獲得的最佳配方，應用于秘魯魷魚高溫處理條件下甲醛的抑制，分析其結果是否與預測的相符合，具體為將最佳的甲醛復合抑制劑和魷魚上清在100℃作用5min后，檢測甲醛和二甲胺含量。

1.2.6 復合甲醛抑制劑反應條件的優化 將復合甲醛抑制劑溶液按一定濃度加入魷魚上清液中，在反應溫度80℃、反應時間30min的條件下，考察pH為3、4、5、6、7、8、9時對魷魚上清甲醛和二甲胺含量的影響;在pH6.0、反應30min條件下，考察反應溫度20、40、60、80、100℃對魷魚上清甲醛和二甲胺含量的影響;在pH6.0、反應溫度80℃的條件下，考察反應時間15、30min，1、2、4、6h對魷魚上清甲醛和二甲胺含量的影響。

1.2.7 數據處理 采用SPSS17.0對數據進行計算和分析，采用Origin 8.0作圖。單因素方差分析用來比較各組間的差異，p＜0.05認為有統計學顯著性差異(*)，p＜0.01認為有統計學極顯著性差異(＊＊)。

2 結果與分析

2.1 復合甲醛抑制劑的混料實驗設計

運用SAS軟件，以甲醛抑制劑茶多酚(A)、氯化鈣(B)和氯化鎂(C)三種物質為參數，其中茶多酚最低值和最高值設計為0和1%，氯化鈣和氯化鎂最低值和最高值為0和1mmol/L，以秘魯魷魚上清中甲醛和二甲胺的減少率為響應值，采用單純型格子法選取實驗點進行混料設計，實驗設計見圖1。10組對魷魚上清甲醛和二甲胺含量的影響見表1。

圖1 單純型格子混料實驗設計Fig.1 Simplicity grid mixture design

表1 復合甲醛抑制劑混料實驗結果Table 1 The results of centroid mixture design of compound formaldehyde inhibitors

表2 回歸方程的方差與顯著性分析Table 2 Square and significant analysis of regression equation

表3 擬合統計Table 3 Fit statistics

根據表1通過SAS進行回歸性分析，得到的回歸方程:

甲醛 FA(Y1)=100.2197A+81.4181B+ 10.84847C+29.64856AB+5.729033AC+167.2907BC

二甲胺DMA(Y2)=26.39681A+39.99622B+ 23.38225C－11.6298AB+54.77995AC+21.92964BC

對回歸結果進一步優化分析，圖2為三因素對甲醛減少率和二甲胺減少率的影響的預測概貌圖。由表1和圖2結果顯示，茶多酚添加量越大，魷魚上清中甲醛減少率越高，而二甲胺的減少量呈現相反的趨勢，茶多酚添加量在0.33%～1.00%時甲醛的減少率高于90%以上。氯化鈣對甲醛減少率的影響呈現拋物線型，在0.59mmol/L時甲醛減少最大，而對二甲胺減少率的影響呈倒拋物線型。甲醛的減少率隨著氯化鎂的添加量增加而下降，而二甲胺的減少呈現拋物線，在0.49mmol/L時達到峰值。

2.2 模型的建立及顯著性檢驗［14］

采用SAS對表1中的數據進行二次多項式回歸擬合，得到甲醛和二甲胺與茶多酚、氯化鈣和氯化鎂添加量的回歸系數及顯著性，結果見表2、表3。

結果可見，三種抑制劑對甲醛和二甲胺減少率的影響都是極顯著的，二次模型的 P值分別為0.0154和0.0466，回歸方程達到顯著水平?；貧w模型的確定系數R2=88.96%和85.75%，調整確定系數R2=82.67%和67.93%，說明82.67%和67.93%的實驗數據的變異性可用此回歸模型來解釋，在實驗范圍內該模型能較好地解釋響應值的變化，即該模型在被研究的整個回歸區域擬合較好，可用來進行響應值預測。

圖2 三種抑制劑對甲醛和二甲胺減少率影響的預測概貌圖Fig.2 Forecast map for effect of three inhibtors on the reducing rate of formaldehyde and dimethylamine

混料設計可以根據各組分的三元等值線圖直觀地觀察各組分間的變化對指標的影響。圖3為茶多酚、氯化鈣和氯化鎂3種組分不同配比條件下甲醛和二甲胺減少率的等值線圖。結果表明，甲醛減少率的最大值在靠近茶多酚和氯化鈣區域，減少氯化鎂的添加量有利于降低魷魚中的甲醛含量，茶多酚是影響甲醛減少率的最大因素。而二甲胺減少率的最大值更靠近氯化鈣，表明氯化鈣對降低魷魚二甲胺含量影響最大，氯化鎂次之，茶多酚最小。前期研究已經發現，0.05%的茶多酚用于秘魯魷魚絲的生產會影響魷魚絲產品的感官品質［9］，結合成本的考慮，減少茶多酚的用量。因此，最佳復合甲醛抑制劑的配比確定為茶多酚0.026%、氯化鈣0.642mmol/L、氯化鎂 0.332mmol/L，此時預測的甲醛減少率為95.1%，二甲胺減少率為39.3%。

圖3 混料設計的等值線圖Fig.3 Isoline of mixture design

2.3 驗證實驗

為了驗證模型預測的準確性，按配比將茶多酚、氯化鈣和氯化鎂分別為 0.026%、0.642mmol/L和0.332mmol/L添加到秘魯魷魚上清中，高溫處理后測定甲醛和二甲胺減少率。結果表明，魷魚上清中甲醛和二甲胺的抑制率分別為94.5%和41.3%，與預測值分別相差0.6%和2.0%。因此，結果表明采用該混料設計復合甲醛抑制劑配方具有準確性和可靠性的特點。

2.4 復合甲醛抑制劑反應條件的優化

圖4 處理pH、溫度和時間對魷魚上清高溫甲醛和二甲胺含量的影響Fig.4 Effect of pH，temperature and time on content of formaldehyde and dimethylamine in squid supernatant

進一步分析了茶多酚、氯化鈣和氯化鎂復合甲醛抑制劑的高溫反應條件，見圖4。結果顯示，在pH 5.0～7.0時魷魚上清中甲醛減少率顯著增加，pH 7.0～9.0時甲醛減少率逐步下降，而pH對二甲胺的減少率無顯著影響，其中pH5.0作用效果最理想。復合抑制劑在弱酸性條件下有利于降低魷魚中的甲醛含量，其成分茶多酚隨著pH增加(pH＞4)可以促進其與甲醛的縮合反應［9］。隨著處理溫度的升高，復合抑制劑對魷魚上清中甲醛和二甲胺減少率都呈現顯著上升的趨勢。隨著加熱時間的延長，甲醛和二甲胺的含量也顯著降低，其中甲醛減少率在0.5h時即達到最高值93.4%，而二甲胺的減少率在2h時達到最高點58%。在魷魚制品加工生成過程中，高溫工藝蒸煮和焙烤工藝是甲醛生成關鍵控制點。因此復合甲醛抑制劑的應用有利于降低高溫加工中甲醛的控制。

3 結論

本研究選取能顯著降低秘魯魷魚高溫甲醛生成的三種抑制劑茶多酚、氯化鈣和氯化鎂，通過SAS中單純型格子混料實驗設計最終確定出它們的最佳配比為茶多酚0.026%、氯化鈣0.642mmol/L、氯化鎂0.332mmol/L。建立了預測模型，并且通過方差分析確定了模型的顯著性。最后根據預測的比值進行驗證實驗，得到與預測值相近的結果，證明了該實驗方法的可靠性和準確性。該復合甲醛抑制劑在高溫處理條件下能有效降低魷魚中甲醛和二甲胺含量，可用于魷魚制品加工過程中甲醛的控制。

［1］Claringbold P J.Use of the simplex design in the joint action of related hormones［J］.Biometrics，1995，40:87－110.

［2］Henry Scheffe.Experiment with mixture［J］.Journal of the Royal Statistical Society Series B(Methodological)，1958(2): 344－348.

［3］Henry Scheffe.The simplex－centroid gesign for experiment with mixtures［J］.Journal of the Royal Statistical Society，Series B (Methodological)，1963(4):235－238.

［4］王欽德，楊堅.食品實驗設計與統計分析［M］.北京:中國農業大學出版社，2002:423－425.

［5］庚晉，周潔.甲醛污染的危害［J］.建材產品與應用，2005 (5):49－51.

［6］Herrera J J，Pastoriza K，Sampedro G，et al.Effect of various cryostabilizers on the production and reactivityof formaldehyde in frozen－stored minced blue whiting muscle［J］.J Agric Food Chem，1999，47:2386－2397.

［7］Racicot L D，Lundstrom R C，Wilhelm K A，et al.Effect of oxidizing and reducing agents on trimethylamine N－oxide demethylase activity in red hake muscle［J］.Agric Food Chem，1964，32:459－464.

［8］Fu Xuyan，Xue Changhu，Miao Benchun，et al.Purification and characterization of trimethylamine－N－oxide demethylase from Jumbo squid(Dosidicus gigas)［J］.Agric Food Chem，2006，54: 968－972.

［9］俞其林，勵建榮，胡子豪，等.茶多酚與甲醛的反應特性研究［J］.中國食品學報，2008，4(2):52－57.

［10］朱軍莉，勵建榮，苗林林，等.基于高溫非酶途徑的秘魯魷魚內源性甲醛控制研究［J］.水產學報，2010，34(3): 375－381.

［11］JianrongLi，JunliZhu，LifangYe.Determination of formaldehyde in squid by high － performance liquid chromatography［J］.Asia Pac J Clin Nutr，2007，16(S1): 127－130.

［12］賈佳，朱軍莉，勵建榮.氣相色譜－氫火焰離子檢測器檢測海產品中的二甲胺［J］.食品科學，2009，30(6):167－170.

［13］黃燕，吳平.SAS統計分析及應用［M］.北京:機械工業出版社，2006.

Optimization of compound inhibitors of formaldehyde in the jumbo squid(Dosidicus gigas)based on mixture design

MIAO Lin－lin，ZHU Jun－li*，LI Jian－rong*
(College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Food Safety Key Lab of Zhejiang Province，Hangzhou 310035，China)

In order to research a new technique of formaldehyde control in the aquatic products，mixture design of SAS software was applied to optimizing compound inhibitors of formaldehyde in the jumbo squid.The best mixture radio of tea polyphenol，calcium chloride and magnesium chlorid was 0.026%，0.642mmol/L，0.332mmol/L，respectively.The model established to predict the equation between responses and three substances mixture radio was obtained by regression analysis.Tea polyphenol had the greatest effect on the reducing rate of formaldehyde，while calcium chloride had the greatest effect on the reducing rate of dimethylamine in squid.The data of analysis of variance and demonstration test indicated that the established models and regressive equation were significance，and could predict the responses value accurately and reliably.The inhibitors reduced effectively the content of formaldehyde and dimethylamine treated at high temperature and pH 6.0.Therefore，the compound inhibitors could be applied to control formaldehyde formation during the squid products thermal processing.

mixture design;formaldehyde;inhibitor;squid

TS202

A

1002－0306(2012)08－0348－04

2011－08－08 *通訊聯系人

苗林林(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:食品檢測。

國家自然科學基金(31000761);浙江省自然科學基金項目(Y3090246);國家質檢總局項目(2009IK180);教育部博士點基金優先發展領域課題(20113326130001)。