蒲公英糖蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)分析

杜曉旭，鐘 潔，段玉峰，鄒柯婷，楊 聞

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062)

蒲公英糖蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)分析

杜曉旭，鐘 潔，段玉峰*，鄒柯婷，楊 聞

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062)

通過DEAE－52纖維素柱層析和Sephadex G－100葡聚糖凝膠層析手段分離純化，從蒲公英中分離純化得到三種蒲公英糖蛋白(TMGP)－a、b、c，采用薄層層析法對其純度進行鑒定，結(jié)果顯示三種成分均為均一組分。經(jīng)分析，蒲公英糖蛋白粗品TMGP和均一品TMGP－a、TMGP－b、TMGP－c中多糖的含量為79.12%、71.23%、70.25%、74.35%;蛋白質(zhì)的含量為:13.35%、19.79%、20.78%、17.60%。β－消除反應說明三種蒲公英糖蛋白均一品都含有O－連接型糖蛋白。經(jīng)紅外光譜分析，TMGP－a糖蛋白可能含有少量硫酸基;TMGP－b糖鏈中可能是硫酸化多糖;TMGP－c含有吡喃糖β－糖苷鍵。

蒲公英，糖蛋白，分離，純化，結(jié)構(gòu)分析

蒲公英糖蛋白粗制品 實驗室自制;DEAE－52纖維素、SephadexG－100 英國Whatman產(chǎn)品;葡萄糖、正丁醇、95%乙醇、無水乙醇、丙酮、氯仿、苯酚、乙醚、氫氧化鈉、雙氧水、硫酸等 均為國產(chǎn)分析純。

DBS－100型電腦全自動部分收集器、DHL－A型電腦恒流泵 上海滬西分析儀器廠;RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;800B型離心機上海安亭科學儀器廠;微量移液器 日本NICHIRYO公司;半微量凱氏定氮蒸餾裝置 上海貝特儀電設備廠;T6型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;EQUINX55型傅立葉變換紅外光譜儀德國Brucher公司;層析柱(2.6cm×80cm和1.5cm× 50cm) 北京昌陽永川實驗器材銷售中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒲公英糖蛋白粗品純化［5－6］取蒲公英糖蛋白粗品0.5g，用10mL蒸餾水完全溶解，上DEAE－52纖維素柱(2.6cm×80cm)，洗脫速度為0.5mL/min，依次用0.1、0.2、0.3、0.5mol/L的NaCl溶液洗脫，用部分收集器收集，每管收集10mL。紫外可見分光光度計檢測280nm處蛋白質(zhì)吸收峰，同時各管用苯酚－硫酸法檢測490nm處糖吸收峰，以洗脫管數(shù)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，做洗脫曲線，收集蛋白質(zhì)和多糖重合的峰，收集液濃縮，透析、冷凍干燥。

取上述所得蒲公英糖蛋白5mg，用蒸餾水配成濃度為0.5mg/mL的樣品溶液，上Sephadex G－100凝膠層析柱(1.5cm×50cm)，用0.1mol/mL NaCl作為洗脫液，洗脫速度為0.5mL/min。每管收集10mL，紫外可見分光光度計檢測280nm處蛋白質(zhì)吸收峰，同時用苯酚－硫酸法檢測490nm處糖吸收峰，收集蛋白和多糖重疊的峰，收集液濃縮，透析、冷凍干燥。

1.2.2 蒲公英糖蛋白的純度鑒定［7］采用薄層層析法。

1.2.3 蒲公英糖蛋白的理化性質(zhì)測定

1.2.3.1 蒲公英糖蛋白的蛋白含量和糖含量測定蛋白質(zhì)含量測定用凱氏定氮法［8］。糖含量測定采用苯酚－硫酸法［9］，以葡萄糖為標準糖。

1.2.3.2 蒲公英糖蛋白的定性實驗［10］定性實驗:顏色、狀態(tài)、溶解性、菲林試劑反應、三氯化鐵反應、碘－碘化鉀反應、CTAB絡合反應、雙縮脲反應。

1.2.4 蒲公英糖蛋白的紫外光譜分析［11］取蒲公英糖蛋白均一品，用蒸餾水溶解，再分成兩等份，其中一份加入1.5mL蒸餾水，另一份加入1.5mL 0.4mol/L NaOH溶液，測反應開始和結(jié)束時(2h)的紫外吸收光譜，并記錄開始與結(jié)束時240nm處的吸光值。

1.2.5 蒲公英糖蛋白的紅外光譜分析［12］將樣品和KBr置于瑪瑙研缽內(nèi)，研細混合均勻，取少許放在模具中壓片，于紅外光譜儀測定樣品在500～4000cm－1區(qū)間的透光率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英糖蛋白的純化

2.1.1 DEAE－52離子交換層析 蒲公英糖蛋白粗品經(jīng)過DEAE－52離子交換柱分離，洗脫結(jié)果如圖1～圖4所示。

圖1 DEAE－52柱層析0.1mol/L NaCl洗脫曲線Fig.1 Elution curve by 0.1mol/L NaCl on DEAE－52 column

由圖1～圖3可知，蒲公英糖蛋白粗品在DEAE－52柱上分別利用0.1、0.2、0.3mol/L NaCl溶液洗脫得到了有效地分離，有明顯的多糖和蛋白重疊峰，收集多糖和蛋白重疊的高峰部分，濃縮、透析、凍干得蒲公英糖蛋白分別命名為TMGP－1、TMGP－2、TMGP－3。

由圖4可以看出，沒有較大的蛋白質(zhì)和多糖的重疊吸收峰，本次實驗沒有收集，也沒有做進一步的研究。

2.1.2 Sephadex G－100凝膠層析 將上述糖蛋白溶解后經(jīng)Sephadex G－100凝膠層析柱進一步分離純化，洗脫結(jié)果如下:經(jīng)DEAE－52柱層析所分離純化后的TMGP－1在Sephadex G－100柱層析過程中第5～15管出現(xiàn)了一個重疊、對稱的吸收峰，收集多糖和糖蛋白重疊的主峰部位，得到蒲公英糖蛋白均一品命名為TMGP－a，經(jīng)濃縮、透析、真空冷凍干燥后得到糖蛋白的質(zhì)量為4.17mg，得率為83.4%;經(jīng)DEAE－52柱層析所分離純化后的TMGP－2在Sephadex G－100柱層析過程中第10～25管出現(xiàn)了一個重疊、較對稱吸收峰，收集多糖和糖蛋白重疊的主峰部位，得到糖蛋白均一品命名為TMGP－b，經(jīng)濃縮、透析、真空冷凍干燥后得到糖蛋白的質(zhì)量為4.05mg，得率為81%;經(jīng)DEAE－52柱層析所分離純化后的 TMGP－3在Sephadex G－100柱層析過程中第10～20管呈現(xiàn)了單一對稱吸收峰，說明TMGP－3經(jīng)DEAE－52柱層析中得到了有效分離，收集主峰部位，經(jīng)濃縮、透析、真空冷凍干燥得糖蛋白均一品命名為TMGP－c，質(zhì)量為4.27mg，得率為85.4%。

圖2 DEAE－52柱層析0.2mol/LNaCl洗脫曲線Fig.2 Elution curve by 0.2mol/L NaCl on DEAE－52 column

圖3 DEAE－52柱層析0.3mol/L NaCl洗脫曲線Fig.3 Elution curve by 0.3mol/L NaCl on DEAE－52 column

圖4 DEAE－52柱層析0.5mol/LNaCl洗脫曲線Fig.4 Elution curve by 0.5mol/L NaCl on DEAE－52 column

2.2 蒲公英糖蛋白的純度鑒定

蒲公英糖蛋白TMGP－a的薄層層析結(jié)果顯示，以氨制硝酸銀噴霧顯色，有淺褐色斑點，因為多糖與氨制硝酸銀可以發(fā)生銀鏡反應，可證明其中含有多糖;用水合茚三酮噴霧顯色，有紫色斑點，證明其中含有蛋白質(zhì)成分;用20%硫酸噴霧，有一褐色斑點，蒲公英糖蛋白被硫酸氧化。測得Rf值分別為0.49、0.46、0.45，因此證明該組分是一種糖蛋白均一品。蒲公英糖蛋白TMGP－b、TMGP－c薄層層析圖也出現(xiàn)了與TMGP－a一樣的現(xiàn)象，因此可以證明TMGP－b和TMGP－c兩種組分也是糖蛋白均一品。

2.3 蒲公英糖蛋白的理化性質(zhì)

蒲公英糖蛋白粗品和蒲公英糖蛋白均一品TGM－a、b、c的理化性質(zhì)測定結(jié)果見表1。

表1 TMGP的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical characteristics of TMGP

由表1可知，蒲公英糖蛋白均易溶于水，不溶于有機溶劑。雙縮脲反應和CTAB絡合反應均為陽性，與碘－碘化鉀反應、斐林試劑反應、三氯化鐵反應都呈陰性，說明蒲公英糖蛋白是非淀粉類多糖，雙縮脲反應呈陽性，說明含有蛋白質(zhì)成分。

2.4 蒲公英糖蛋白紅外光譜分析

TMGP－a的紅外光譜圖分別在 3410.18、2923.29、2856.67、1626.51、1353.42、1230.05、1023.24、611.68cm－1處有吸收峰;TMGP－b的紅外光譜圖分別在 3437.18、2922.69、2847.28、1629.57、1353.64、1273.45、1032.13cm－1處有吸收峰;TMGP－c的紅外光譜圖分別在3425.70、2922.75、2312.39、1627.06、1332. 66、1022.84、890.31、599.01cm－1處有吸收峰。

由蒲公英糖蛋白的紅外圖譜得知:蒲公英糖蛋白均一品 TMGP－a、b、c分別在3425、2922、1640、1352、1022cm－1附近都有吸收峰，這些區(qū)域的吸收峰都是多糖和蛋白分子的特征吸收峰。其中在3425cm－1左右吸收峰是羥基O－H的伸縮振動［13］，由于分子內(nèi)羥基間形成氫鍵而使吸收峰變寬;在2922cm－1左右較弱的吸收峰是糖的C－H伸縮振動所引起;在1640cm－1附近出現(xiàn)的吸收峰是C=0(羧基或酰胺羰基)伸縮振動和 N－H變角振動［14］，在1400cm－1左右較弱的吸收峰是C－H變角振動吸收;在1000～1022cm－1處出現(xiàn)的吸收峰為C－O鍵吸收峰，表明三種糖蛋白分子都含有吡喃環(huán)［15］。TMGP－a在1230cm－1處的較弱吸收峰可能是S=O的伸縮振動吸收，表明該糖蛋白可能含有少量硫酸基;TMGP－b在1353、1273cm－1處的較弱吸收峰分別是磺酰基和硫酸基中S=O的伸縮振動吸收，說明糖鏈中可能是硫酸化多糖;TMGP－c在890cm－1處有特征吸收峰，表明其糖鏈是與β－糖苷鍵相連。

2.5 蒲公英糖蛋白紫外光譜分析

蒲公英糖蛋白的紫外圖譜顯示，TMGP－a、TMGP－b、TMGP－c三組分在280nm左右有一明顯的尖形峰，此峰是糖蛋白最明顯的特征吸收峰。三種組分的β－消除反應前后在240nm處的吸光度值發(fā)生變化，從而可以說明蒲公英糖蛋白 TMGP－a、TMGP－b、TMGP－c經(jīng)過NaOH處理之后，在240nm處產(chǎn)生明顯吸收，說明三種蒲公英糖蛋白均一品中都含有O－糖肽鍵，這是因為在稀氫氧化鈉溶液作用下，O－型糖肽鍵可以發(fā)生β－消除反應，與糖鏈連接的絲氨酸轉(zhuǎn)化成ɑ－氨基丙烯酸，而蘇氨酸則可以轉(zhuǎn)化成ɑ－氨基丁烯酸，所形成的不飽和氨基酸就會在240nm處有顯著的吸收。

3 結(jié)論

本實驗采用 DEAE－52纖維素柱層析和Sephadex G－100葡聚糖凝膠層析分離純化手段，從蒲公英中純化得到三種糖蛋白TMGP－a、b、c，采用凝膠柱層析和薄層層析法對其純度進行鑒定，結(jié)果顯示三種成分均為均一組分。通過各種理化性質(zhì)的檢驗，證明蒲公英糖蛋白里不含有淀粉。蒲公英糖蛋白粗品TMGP和純品TMGP－a、TMGP－b、TMGP－c當中多糖的含量為79.12%、71.23%、70.25%、74.35%;蛋白質(zhì)的含量為13.35%、19.79%、20.78%、17.60%。通過紅外光譜分析可知，蒲公英糖蛋白純品TMGP－a、b、c分別在3425、2922、1640、1352、1022cm－1附近都有吸收峰，這些區(qū)域的吸收峰都是多糖和蛋白分子的特征吸收峰。TMGP－a在1230cm－1處的較弱吸收峰可能是S=O的伸縮振動吸收，表明該糖蛋白可能也含有少量硫酸基;TMGP－b在1353、1273cm－1處的較弱吸收峰分別是磺酰基和硫酸基S=O的伸縮振動吸收，說明可能是硫酸化多糖;TMGP－c在890cm－1處有特征吸收峰，表明其糖鏈是與β－糖苷鍵相連。

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Isolation，purification and analysis of glycoprotein from Taraxacum mongolicum

DU Xiao－xu，ZHONG Jie，DUAN Yu－feng*，ZOU Ke－ting，YANG Wen
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

Three fractions named respectively TMGP－a，TMGP－b，TMGP－c were isolated and purificated from Taraxacum mongolicum by using EDAE－52 cellulose and SephadexG－100 column chromatography.The purity was identified by thin layper chromatography(TLC)，and the results showed that three components were all homogeneous.Taraxacum mongolicum glycoprotein crude TMGP and pure TMGP－a，TMGP－b，TMGP－c，which polysaccharide content of 79.12%，71.23%，70.25%，74.35%，protein content:13.35%，19.79%，20.78%，17.60%. β－elimination reaction indicated the linkagetype of three Taraxacummong Dlicum glycoprotein was o－glycoside linkage.The infrared spectrum analysis，TMGP－a glycoprotein might contain a small amount of sulfate，TMGP－b sugar chain might be sulfated polysaccharide sugar，TMGP－c was pyranose β－glycoside linkage.

Taraxacum mongolicum;glycoprotein;isolation;purification;structure analysis

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0198－04

蒲公英(Taraxacum mongolicum)別名蒲公草、黃花地丁、婆婆丁、黃花三七，屬菊科多年生草本植物［1］。這種植物營養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、微量元素及維生素等［2］;藥用價值也高，具有抗腫瘤、降血壓、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗衰老等作用［3］。目前對蒲公英的研究僅限于蒲公英的總黃酮、酚酸類和綠原酸等活性物質(zhì)［4］及蒲公英糖蛋白的提取工藝和抗氧化活性，國內(nèi)外對于蒲公英糖蛋白的結(jié)構(gòu)研究未見報道。本實驗研究了蒲公英糖蛋白的純化方法，對糖蛋白的結(jié)構(gòu)進行了初步分析，以期為蒲公英的綜合開發(fā)利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2011－07－27 *通訊聯(lián)系人

杜曉旭(1988－)，女，碩士，研究方向:天然活性產(chǎn)物。

陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2006B18)。