米糟蛋白酶解制備生物肽及其抗氧化活性的研究

曲文娟，馬海樂，賈俊強，潘忠禮

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013; 2.美國加州大學戴維斯分校生物與農業工程學院，美國戴維斯95616; 3.美國農業部西部研究中心，美國伯克利94710)

米糟蛋白酶解制備生物肽及其抗氧化活性的研究

曲文娟1，馬海樂1，賈俊強1，潘忠禮2，3

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013; 2.美國加州大學戴維斯分校生物與農業工程學院，美國戴維斯95616; 3.美國農業部西部研究中心，美國伯克利94710)

為了高值化利用米糟資源，以米糟蛋白為原料通過酶解法生產一種高效、低毒的天然米糟抗氧化肽。實驗結果表明:7種蛋白酶中，中性酶為最佳酶選，其最佳酶解條件為:米糟蛋白質量濃度(S)為10g/100mL，中性酶濃度(E/S，質量分數)為8%，pH為6.0，溫度為60℃，時間為30min。在該最佳酶解條件下，米糟生物肽的得率為18.50%，水解度為2.84%，DPPH·(1，2－二苯代苦味肼基自由基)清除率為90.10%。該米糟生物肽具有較強的DPPH和羥自由基清除能力，其IC50值(抗氧化活性為50%時所對應的米糟生物肽質量濃度)分別為1.136、0.169g/L，還具有較強的還原能力和Fe2+螯合能力(IC50值為2.127g/L)。由此得出，米糟蛋白是一種很好的米糟抗氧化肽生產原料，且該生物肽是一種較為理想的天然抗氧化劑產品。

米糟蛋白，抗氧化劑，酶解法，生物肽，抗氧化活性

自由基理論認為，隨著年齡增長或在某些病理狀態下以及機體受到創傷時，體內抗氧化酶活性下降，人體在生理代謝過程中產生的含氧自由基不能及時清除，積累過多的自由基將與機體內的一些生物大分子發生反應生成大量氧化物或過氧化物可導致許多慢性病，如動脈硬化癥［1］、關節炎、癌癥［2］及其它變性疾病［3］。因此，尋找高效、低毒的抗氧化劑一直是近年來研究者們關注的課題。天然抗氧化肽因具有高效清除自由基且安全性高的優勢，引起了人們的廣泛關注。目前已有一些關于天然抗氧化肽的研究，如酪蛋白抗氧化肽、油茶餅粕抗氧化肽、花生抗氧化肽等，且研究主要集中在抗氧化肽的制備和活性方面［4－8］。國內外也已有關于大米抗氧化肽的研究［9－12］，多是以大米作為生產原料，對大米淀粉加工后的副產物－米糟資源的高效利用較少，且主要側重于制備和功能性方面的研究，對其抗氧化活性評價指標的全面系統研究較少。我國的稻谷年產量為1.85億t，居世界首位，大米資源極其豐富。米糟作為大米淀粉加工后的主要副產物，蛋白質含量高達70%，但因其色澤和水溶性較差，主要被用作廉價動物飼料或直接扔棄，造成了嚴重的資源浪費。因此，為了高值化利用米糟蛋白資源生產出一種高效、低毒的天然米糟抗氧化肽，本實驗通過酶篩選和正交優化實驗獲得了米糟生物肽的最佳酶解制備工藝條件。同時，通過多項抗氧化指標(DPPH·清除率、·OH清除率、Fe2+螯合率和還原能力)系統表征了米糟生物肽的抗氧化活性。本文采用了酶解法制備米糟抗氧化肽，以期達到安全性高，生產條件溫和，可定位生產特定肽的目的，為米糟資源的有效利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糟蛋白原料 純度為70%，嘉吉飼料鎮江有限公司;1，2－二苯代苦味肼基自由基(DPPH·) Sigma公司;堿性酶和胰蛋白酶 Novozymes公司;風味酶、中性酶、復合酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 無錫市雪梅酶制劑科技有限公司，7種蛋白酶的性能見表1;其他化學試劑 均為分析純。

WFJ7200型分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;DZF－6020型真空干燥箱 深圳市愛特爾電子科技有限公司;SHB－Ⅲ型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;SHZ－88A型往復式水浴恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠;LD5－2A型離心機 北京醫用離心機廠;PHS－25A型數字pH計 上海大普儀器有限公司;SK－Ⅰ型快速混勻器 江蘇金壇醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶篩選實驗 稱取米糟蛋白5g、酶0.25g，加水至100mL，在各酶最適酶解條件下水解2h，然后在100℃下滅酶20min，在3500r/min下離心，取上清液分別測定水解度、DPPH·清除率和IC50值。

表1 7種蛋白酶的最適酶解條件和酶活性Table 1 Optimum enzymolysis conditions and enzymatic activities of seven protease

1.2.2 工藝優化實驗 根據預實驗結果發現，酶解時間對實驗結果影響不顯著，故將酶解時間固定為30min。選取米糟蛋白質量濃度(S)、中性酶濃度(E/S，質量分數)、酶解pH、酶解溫度為4個考察因素，對每個因素選取4個水平，進行L16(45)正交實驗，因素水平和實驗設計見表2和表3，以DPPH·清除率為考察指標，對酶解條件進行優化實驗。

表2 正交實驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 分析實驗

1.2.3.1 水解度的測定 水解度(degreeof hydrolysis，DH)是按文獻［13］的方法測定得。水解度即米糟蛋白酶解過程中，水解的肽鍵數與總肽鍵數之間的比值，用以表征米糟蛋白水解的程度。水解度(質量分數，%)的計算公式如下:

式中:DH－水解度，%;W1－米糟生物肽中游離氨基氮含量(采用pH－stat法測定)，g/mL;W2－米糟蛋白質量濃度，g/mL;5.93－米糟蛋白的換算系數。

1.2.3.2 DPPH·清除率的測定 對文獻［14］的方法進行適當調整，移取2mL米糟生物肽溶液置于試管中，加入2mL 0.04g/L的DPPH乙醇溶液，混合均勻，在室溫下反應20min，3500r/min離心10min，取上清液在517nm處測吸光值為Ai(樣品組的吸光值);另各取2mL上述濃度的米糟生物肽溶液置于試管中，再加入2mL無水乙醇，混合均勻，在室溫下反應20min，3500r/min離心10min，取上清液在517nm處測吸光值記為Aj(空白組的吸光值);以2mL雙蒸水和2mL 0.04g/L DPPH乙醇溶液作為對照，其吸光值記為Ah(對照組的吸光值)。以維生素C作為對照樣品。DPPH·清除率(%)的計算公式如下:

1.2.3.3 羥自由基(·OH)清除率的測定 對文獻［15］的方法進行適當調整，移取2mL米糟生物肽溶液置于試管中，依次加入2mL 6mmol/L的硫酸亞鐵溶液(FeSO4)、2mL 6mmol/L的雙氧水溶液(H2O2)，混合均勻，在室溫下反應10min，再加入2mL 6mmol/ L水楊酸溶液，混合均勻，在室溫下反應30min，取上清液在510nm處測其吸光值記為Ae(樣品組的吸光值);當用雙蒸水代替水楊酸溶液時測得的吸光值記為Af(空白組的吸光值);對照組以雙蒸水代替米糟生物肽溶液測得的吸光值記為Ad(對照組的吸光值)。以維生素C作為對照樣品。羥自由基清除率(%)的計算公式如下:

1.2.3.4 Fe2+螯合率的測定 對文獻［16］的方法進行適當調整，移取1mL米糟生物肽溶液置于試管中，依次加入3.7mL去離子水、0.1mL 2mmol/L氯化亞鐵溶液(FeCl2)、3.7mL 5mmol/L亞鐵嗪溶液(Ferrozine)，混合均勻，在室溫下反應10min，取上清液在562nm處測其吸光值記為Aa(樣品組的吸光值);對照組以去離子水代替米糟生物肽溶液測得的吸光值記為Ab(對照組的吸光值)。以乙二胺四醋酸(EDTA)作為對照樣品。Fe2+螯合率(%)的計算公式如下:

1.2.3.5 還原能力的測定 還原能力是按文獻［17］的方法測定。吸光值越高，代表米糟生物肽的還原能力越強。同時以維生素C作為對照樣品。

1.2.3.6 IC50值的測定 IC50值(半抑制濃度)代表抗氧化活性為50%時所對應的米糟生物肽質量濃度(g/L)。配制不同濃度的米糟生物肽溶液，測定其各自的抗氧化活性，得出米糟生物肽濃度與抗氧化活性的關系方程，從而計算抗氧化活性為50%時所對應的米糟生物肽質量濃度即為IC50值。IC50值越低，表明米糟生物肽的抗氧化活性越強。

所有樣品均取三個平行樣進行分析測試，實驗數據均記錄其平均值。采用Excel軟件對DPPH·清除率進行Anova分析用來判斷數據之間是否存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 酶篩選實驗結果

本文對7種常用蛋白酶對米糟蛋白的酶解效果分別進行評價，實驗結果見圖1。

圖1 各酶解產物的DPPH·清除率、水解度和IC50值Fig.1 DPPH·scavenging rate，degree of hydrolysis and IC50value of each hydrolysate

從圖1可以看出，米糟蛋白(濃度為5g/100mL)經7種蛋白酶水解制備的米糟生物肽均具有一定的DPPH·清除效果。這是因為米糟蛋白被蛋白酶徹底水解成小分子量片段的多肽(1000～5000u)，該多肽含有大量的末端疏水性氨基酸［18］，如Trp、Tyr、Phe和Pro，經之前研究證實該多肽具有抗氧化的功效［19］。因此可以說明米糟蛋白經蛋白酶水解制備的米糟生物肽具有抗氧化活性，可以高效清除DPPH·。

從圖1還發現，米糟蛋白經胰蛋白酶水解所得的生物肽具有最高的水解度，米糟蛋白經中性酶水解所得的生物肽對DPPH·的清除率最高，米糟蛋白經木瓜蛋白酶水解所得的生物肽具有最低的IC50值。綜合考慮水解度、DPPH·清除率和IC50值評價指標，發現經中性酶水解制備的米糟生物肽具有較優的水解度、DPPH·清除率和IC50值，故將中性酶作為最佳酶選，用于下一步的米糟蛋白酶解條件優化實驗。

2.2 工藝優化實驗結果

測定優化實驗中各米糟生物肽的DPPH·清除率，實驗結果見表3。

表3 正交實驗設計及結果Table 3 Design and result of orthograpbic experiment

從表3的極差分析結果可以看出，因素主次順序為:A＞D＞B＞C，最優方案為A4B4C2D2。由此得出:米糟蛋白質量濃度對米糟生物肽的DPPH·清除率影響最大，其次是酶解溫度、中性酶濃度、酶解pH。同時獲得了米糟生物肽的最佳酶解制備條件為:米糟蛋白質量濃度(S)為10g/100mL，中性酶濃度(E/S，質量分數)為8%，pH為6.0，溫度為60℃，時間為30min。

對正交實驗數據進行方差分析，分析結果如表4所示。

從表4中發現，米糟蛋白質量濃度和酶解溫度因素對結果影響很顯著，而中性酶濃度和酶解pH對結果影響不顯著(顯著性考察水平為0.05)，方差分析結果與極差分析結果一致。由于最優方案并未出現在正交表中，所以對最優組合進行3次重復驗證實驗，驗證實驗結果表明米糟生物肽產品的DPPH·清除能力重現性良好。同時在該最佳條件下，米糟生物肽的得率為18.50%(質量分數)，水解度為2.84%，DPPH·清除率為90.10%。

表4 正交實驗方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of orthogonal experiment

2.3 米糟生物肽抗氧化活性評價結果

2.3.1 米糟生物肽清除DPPH·的效果分析 DPPH·是一種對人體有害的自由基。因此目前以DPPH·清除率作為評價物質是否具有抗氧化活性的指標之一［14］。本文對米糟生物肽和維生素 C(對照)的DPPH·清除能力分別進行評價，實驗結果如圖2所示。

圖2 米糟生物肽(a)和維生素C(b)的DPPH·清除率Fig.2 Scavenging rate of rice dreg peptide(a) and vitamin C(b)on DPPH radical

從圖2可以看出，隨著米糟生物肽和維生素C濃度的增大，其對DPPH·的清除率均呈現增加的趨勢。通過對它們各自濃度與DPPH·清除率之間進行擬合，得到各自的回歸方程，由此計算得到米糟生物肽的 IC50值為 1.136g/L，維生素 C的 IC50值為0.005g/L，且米糟生物肽的 IC50值約為維生素 C的214倍。

2.3.2 米糟生物肽清除羥自由基的效果分析 對米糟生物肽和維生素C(對照)的羥自由基清除能力分別進行評價，實驗結果見圖3。

從圖3可以看出，米糟生物肽和維生素C濃度的增加均對羥自由基清除率起促進作用。通過軟件擬合濃度與羥自由基清除率之間的關系，得到各自的回歸方程。結果得到:米糟生物肽的 IC50值為0.169g/L，維生素C的IC50值為0.086g/L，米糟生物肽的IC50值約為維生素C的1.96倍。

圖3 米糟生物肽(a)和維生素C(b)的羥自由基清除率Fig.3 Scavenging rate of rice dreg peptide(a) and vitamin C(b)on hydroxyl radical

2.3.3 米糟生物肽對Fe2+螯合能力的效果分析

Fe2+離子可以通過Fenton反應分解過氧化物產生大量的自由基，導致人類產生一些心血管疾病。同時，Fe2+還被認為是產生氧自由基和促進油脂過氧化的主要原因之一［20］。本文對米糟生物肽和EDTA(對照)的Fe2+螯合能力分別進行評價，實驗結果如圖4所示。

圖4 米糟生物肽(a)和EDTA(b)的Fe2+螯合率Fig.4 Chelation rate of rice dreg peptide(a) and EDTA(b)on Fe2+

由圖4可見，隨著米糟生物肽和EDTA濃度的增加，其對Fe2+螯合能力均呈現增加的趨勢。由此得出，米糟生物肽可以降低Fe2+的濃度，從而預防氧化損傷。通過軟件擬合濃度與Fe2+螯合率之間的關系，得到各自的回歸方程。結果得出:米糟生物肽的IC50值為2.127g/L，EDTA的IC50值為0.034g/L，米糟生物肽IC50值約為EDTA的62.9倍。

2.3.4 米糟生物肽還原能力的效果分析 對米糟生物肽和維生素C(對照)的還原能力分別進行分析，實驗結果見圖5。

圖5 米糟生物肽和維生素C的還原能力Fig.5 Reduction ability of rice dreg peptide and vitamin C

在還原能力分析中得知:樣品在700nm處的吸光值越大，代表樣品的還原能力越大［17］。因此，我們得出:隨著米糟生物肽濃度的增大，其還原能力也進一步增大;維生素C與米糟生物肽表現出相似的規律，但是增加速率較其快。

3 結論

3.1 通過酶篩選和酶解工藝優化實驗，對米糟蛋白酶解制備米糟生物肽的工藝條件進行優化。結果表明:中性酶為最佳酶選，其最佳酶解條件為:米糟蛋白質量濃度(S)為10g/100mL，中性酶濃度(E/S，質量分數)為8%，pH為6.0，溫度為60℃，時間為30min。在該最佳酶解條件下，米糟生物肽的得率為18.50%，水解度為 2.84%，DPPH· 清除率為90.10%。由此得出:米糟蛋白是一種很好的米糟生物肽生產原料。采用上述酶解工藝條件以米糟蛋白為原料制備米糟生物肽，經實踐擴大量工藝生產發現，產品品質重現性良好，應用經濟性也較好。

3.2 對米糟生物肽的抗氧化活性進行評價，結果表明:米糟生物肽具有較強的DPPH·清除能力，其IC50值為1.136g/L;米糟生物肽具有較強的羥自由基清除能力，其IC50值為0.169g/L;米糟生物肽對Fe2+離子具有較強的螯合作用，其IC50值為2.127g/L;米糟生物肽也表現出較強的還原能力。由此得出:米糟生物肽具有一定程度的抗氧化活性，且具有低毒的優勢，是一種較為理想的天然抗氧化劑產品，可以用作人工合成抗氧化劑的替代品。

3.3 與維生素C和EDTA對照相比，米糟生物肽的抗氧化活性相對較弱，考慮到米糟生物肽的純度對其抗氧化活性影響很大，因此非常有必要對米糟抗氧化肽進一步純化。同時，對米糟生物肽的結構進行表征，建立其結構與抗氧化活性的關系，進一步提高其抗氧化活性，以期生產出高效的米糟抗氧化肽產品。

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Study on biological peptide preparation from rice dreg protein by enzymatic hydrolysis and its antioxidative activity

QU Wen－juan1，MA Hai－le1，JIA Jun－qiang1，PAN Zhong－li2，3
(1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China; 2.Department of Biological and Agricultural Engineering，University of California，Davis 95616，America; 3.United States Department of Agriculture West Regional Center，Berkeley 94710，America)

In order to high－valued utilize the rice dreg resources，a natural antioxidative peptide with high effective and low toxic properties was produced from rice dreg protein by the enzymatic hydrolysis method.The results showed that the neutral enzyme was optimum among seven protease.The optimum enzymatic hydrolysis conditions were 10g/100mL rice dreg protein concentration(S)，8%neutral enzyme concentration(E/S，w/w)，pH 6.0，temperature of 60℃and time of 30min.Under the optimum condition，rice dreg biological peptide had the yield of 18.50%，degree of hydrolysis of 2.84%and DPPH· scavenging rate of 90.10%.The results also showed that rice dreg biological peptide had strong scavenging capabilities on DPPH·and hydroxyl free radicals with IC50values of 1.136 and 0.169g/L.Moreover，the rice dreg biological peptide had strong reducing capability and chelating Fe2+ability with IC50value of 2.127g/L.It was concluded that rice dreg protein was a good source for producing antioxidative peptide and the rice dreg biological peptide was an ideally natural antioxidants.

rice dreg protein;antioxidants;enzymatic hydrolysis;biological peptide;antioxidative activity

TS210.9

A

1002－0306(2012)08－0183－06

2011－07－26

曲文娟(1980－)，女，博士，講師，研究方向:功能食品。

江蘇大學高級技術人才科研啟動基金項目(10JDG121);江蘇大學博士后基金項目(1143002027);江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD);科技部國際合作項目(2009DFA32000)。