銀杏類黃酮O-甲基轉移酶活性的高效液相色譜分析

仲月明，張傳麗，陳 鵬，*，沈丹紅，吳秋月，周長遠

(1.揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州225009; 2.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州225009)

銀杏類黃酮O-甲基轉移酶活性的高效液相色譜分析

仲月明1，張傳麗2，陳 鵬1，*，沈丹紅1，吳秋月1，周長遠1

(1.揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州225009; 2.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州225009)

首次明確了銀杏葉片類黃酮生物代謝關鍵酶O－甲基轉移酶(flavonoid O－methyltransferase，FOMT)活性的HPLC測定技術與方法。采集揚州大學銀杏種質資源圃銀杏雄株成熟葉片，提取粗酶液，根據FOMT催化反應生成S－腺苷－L－高半胱氨酸(SAH)的原理，以山奈酚、槲皮素和異鼠李素等3種黃酮苷元為反應底物，采用優化的HPLC體系檢測樣品中FOMT催化反應生成的SAH峰面積，通過標準曲線求得不同反應底物的FOMT相對活性。FOMT活性反應生成物SAH在1.5～20μg/mL內呈良好的線性關系，RSD為2.1%(n=5)，建立了FOMT活性測定優化體系。不同反應底物的FOMT活性表現不同，山奈酚與異鼠李素顯著高于槲皮素。FOMT活性HPLC測定方法準確、快速、可靠、靈敏度高。

銀杏，雄株，葉片，類黃酮O－甲基轉移酶(FOMT)活性，高效液相色譜

銀杏(Ginkgo biloba L.)素有“活化石”之稱，集食用、保健、藥用、生態和觀賞等價值于一體。其葉片已得到規模化開發利用并發展成為集約化、標準化經營的國際性重大產業［1－3］。銀杏葉中類黃酮是次生代謝產物，是銀杏葉的主要功能性成分。其主要包括單黃酮、雙黃酮和兒茶素等3類。其中具有生物活性的單黃酮類化合物主要由山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)和異鼠李素(isorhamnetin)等黃酮苷元及其與有關糖類結合而成的糖苷組成(圖1)。其可以改善心腦血管循環，清除體內自由基，具有提高自身免疫力和抗氧化、抗衰老、抗癌、抗菌、抗過敏及保護肌膚等功效。上述三種黃酮苷元是黃酮類化合物的主要成分，也是銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)質量控制的主要檢測對象。FOMT是類黃酮合成的關鍵酶，其催化S－腺苷甲硫氨酸(S－adenosyl－L－methionine，SAM)中－CH3以O－C鍵方式轉移到類黃酮的A、B環上，生成類黃酮甲基衍生物和S－腺苷－L－高半胱氨酸(S－adenosyl－L－homocysteine，SAH)(圖2)，這不僅可以降低類黃酮的化學反應活性，而且可以增加其脂溶性，擴大其在細胞內的分布范圍［4］，賦予類黃酮更多的生理生化特性。酶活性測定有定時、連續監測和平衡等方法，由于受到反應濃度、反應時間、反應溫度及試劑等的影響，且有的方法費時費工，因而其在應用中受到一定限制。近年來采用高效液相色譜 法 (High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC)高效、快速測定酶活性的研究較多［5－7］。本研究首次以銀杏雄株葉片為實驗材料，根據其催化反應底物黃酮苷元生成SAH的原理，采用HPLC檢測分析，從而確定FOMT的活性，為銀杏優質葉用資源的選育提供理論依據和技術支撐。

圖1 銀杏單黃酮基本結構Fig.1 Basic structure of single flavones of Ginkgo

圖2 植物類黃酮甲基化模式圖Fig.2 The pattern of plant flavones methylation

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5株銀杏雄株葉片 揚州大學銀杏種質資源圃，液氮研磨、加提取緩沖液(1∶5，w/v)、過濾、離心、粗酶提取;槲皮素、異鼠李素、山奈酚 上海同田生物有限公司，純度＞98%;S－腺苷－L－高半胱氨酸SAH標準品、S－腺苷－L－甲硫氨酸SAM 美國Sigma公司，純度 ＞98%;辛烷磺酸鈉 美國 Alfa公司; 25mmol/L MgCl2Takara公司;甲酸銨、甲酸、DMSO、甲醇(色譜純) 上海生物工程有限公司;怡寶水 南京大吉泉水飲料有限公司。

LC－10AT高效液相色譜儀 配有島津LC－10A泵、SPD－10A紫外檢測器、77251進樣閥，日本島津儀器有限公司;水浴鍋(SHA－C) 國華儀器有限公司;多用循環水真空泵 上海亞榮生化儀器有限公司;3K－15型高速冷凍離心機 Sigma公司;KQ－500B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 FOMT活性HPLC測定分析的技術路線 銀杏雄株葉片FOMT活性HPLC測定的技術流程如圖3所示。在HPLC檢測前，整個過程需要在低溫條件下進行，從而保證酶的活性。

圖3 銀杏雄株葉片FOMT活性HPLC測定分析流程圖Fig.3 Flowchart of analysis on FOMT activity by HPLC for the male leaves in Ginkgo

1.2.2 色譜條件 色譜柱:采用DiamonsilTM(鉆石) C18柱(4.6mm×150mm，5μm);流動相為甲酸銨－甲醇溶液(7∶40)［8－9］，稱取甲酸銨5.04g，辛烷磺酸鈉0.8g，加水溶解，甲酸調節 pH至3.48，加水稀釋至800mL，加甲醇140mL，混勻，流速為1.0mL/min，紫外檢測波長為258nm，柱溫為28℃;進樣15μL。

1.2.3 標準曲線 精密量取SAH先溶于少量50%的DMSO中，然后用流動相將其配制為母液，母液再進行逐級稀釋，分別配制成標準溶液為20、15、10、5、2.5、1.5μg/mL，0.45μm濾膜過濾，進樣15μL，記錄色譜圖，以SAH峰面積(A)為橫坐標，SAH濃度(C)為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4 酶活性單位 酶活性單位的定義為:在下述測定條件下，每30min生成SAH 1pmoL的酶量為1個活性單位U。

1.2.5 FOMT粗酶液提取 參照Paolo、Sabrina等文獻［5－6，10－11］確定FOMT粗酶提取方法:取銀杏雄株新鮮葉片20g，液氮研磨，加入100mL提取緩沖液(1∶5，w/v);過濾，離心，取上清液。

1.2.6 FOMT活性測定體系優化

1.2.6.1 溫度影響酶活性變化曲線 酶量恒定(200μL)，反應30min，山奈酚為底物，反應溫度設定為20、25、30、35、40、45℃。0.45μm濾膜過濾，進樣15μL，記錄色譜圖，保留時間定性，峰面積定量。

1.2.6.2 pH影響酶活性變化曲線 酶量恒定(200μL)，反應30min，山奈酚為底物，緩沖液pH設為5、6、7、7.5、8、9、10。0.45μm濾膜過濾，進樣15μL，記錄色譜圖，保留時間定性，峰面積定量。

1.2.6.3 底物濃度影響酶活性變化曲線 酶量恒定(200μL)，反應30min，山奈酚為底物，底物濃度分別為20、50、100、200、400μmol/L。0.45μm濾膜過濾，進樣15μL，記錄色譜圖，保留時間定性，峰面積定量。

1.2.7 不同底物FOMT活性測定比較 將5株雄株葉片混合，分別以山奈酚、異鼠李素、槲皮素為底物，應用優化的酶活反應體系測定FOMT活性。

2 結果與討論

2.1 FOMT粗酶液提取及其反應底物的選用

參照Paolo、Sabrina等文獻［5－6，10－11］確定提取緩沖液為Tris－Hcl(8.0)50mmol/L，EDTA 1mmol/L，PMSF 1mmol/L，NaCl 50mmol/L，Triton X－100 0.1% (v/v);4層紗布過濾，4℃，11000r/min離心30min，取上清液。粗酶液保存于－20℃備用。粗酶提取過程需在低溫下進行，本實驗的整個過程選擇在冰上完成。

山奈酚、槲皮素和異鼠李素是具有生物活性的黃酮苷元，也是GBE質量檢測的主要指標，因此本實驗選擇其分別作為酶活反應底物。

2.2 HPLC條件的選擇與優化

選取不同比例的甲醇－甲酸銨溶液進行分離度實驗，結果顯示甲醇和甲酸銨溶液的比例為7∶40時，出峰效果最好。流動相的pH對雜質的分離度有較大影響，pH越小，雜質分離度越大。考慮到pH過低容易對色譜柱產生損害，實驗選取pH 3.0～4.0范圍進行實驗，多次實驗結果表明pH為3.48時，SAH的出峰及保留時間都較穩定，可以滿足含量測定的要求。本文選擇不同柱溫進行了實驗，結果顯示溫度對測定結果影響較大，溫度越高保留時間越短，本實驗選擇接近室溫的28℃為柱溫，容易確保實驗條件的一致性。SAH的保留時間為14min左右。具體色譜圖見圖4、圖8～圖10。

2.3 SAH溶液標準曲線繪制及色譜圖

以SAH峰面積(A)為橫坐標，SAH濃度(C)為縱坐標進行線性回歸，得到SAH濃度相應于SAH峰面積的線性回歸方程為:y=6E－07x+0.3135，r= 0.9991(n=6);即SAH濃度1.5～20μg/mL內，其峰面積與濃度呈良好的線性關系。由圖4得知，采用SAH對照品進樣分析，確定 SAH的保留時間為14min左右。

圖4 SAH標準溶液色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of SAH in standard solution

2.4 HPLC檢測精密度實驗

取SAH對照品20μg/mL溶液，重復進樣5次，記錄峰面積和保留時間并計算相對標準偏差(RSD)，結果表明 SAH的RSD為2.1%，精密度良好。

2.5 HPLC檢測回收率實驗

取樣品20μL，加入對照品20μg/mL溶液20μL，混勻，取15μL上樣，重復進樣3次。計算SAH的加樣回收率，結果為100.7%。

2.6 FOMT活性的HPLC測定

2.6.1 酶活反應體系優化

2.6.1.1 酶促反應隨溫度的變化 本研究設定6個溫度值來探明銀杏中FOMT活性反應的最適溫度條件，由圖5可知，銀杏FOMT活性反應最適溫度為25℃。不同植物FOMT活性反應的最適溫度稍有不同，康乃馨FOMT活性反應溫度為25℃［10］，菊科麻花FOMT為30℃［5］，大麥中 FOMT為20℃［12］，結果表明，銀杏FOMT活性反應最適溫度與其他植物的比較接近。

圖5 酶促反應隨溫度的變化Fig.5 Changes of enzymatic reaction in the different temperatures

2.6.1.2 酶促反應隨pH變化 FOMT維持活性的最適pH為7.0～8.0，不同來源稍有差異。本研究選取6個pH進行實驗，結果顯示銀杏FOMT活性反應的最適pH范圍為7.5～8.0。說明銀杏FOMT維持活性的pH在正常范圍內。與其他植物差異不大，如康乃馨FOMT最適pH為中性范圍，麻花FOMT為7.6，鳶尾FOMT為7.5～8.0［13］。

圖6 酶促反應隨pH變化Fig.6 Changes of enzymatic reaction in the different pH

2.6.1.3 酶促反應隨底物濃度變化 底物濃度在酶活性反應中也具有非常重要的作用，本實驗設定5個底物濃度梯度，實驗結果表明，底物濃度為100μmol/L時，酶活性最高，因此本實驗確定100μmol/L為FOMT活性反應的最佳濃度。

因此，酶促反應的最適溫度為25℃，最適pH范圍在7.5～8.0，最適底物濃度為100μmol/L。得出FOMT活性反應的優化體系:Tris－Hcl(7.5)50mmol/L，β－巰基乙醇 14mmol/L，底物 100μmol/L，SAM 40μmol/L，Mg2+12.5mmol/L，25℃水浴反應30min，沸水浴5min終止反應。

圖7 酶促反應隨底物濃度變化Fig.7 Changes of enzymatic reaction on the different substrate concentrations

2.6.2 不同底物樣品FOMT活性測定比較 根據2.6.1酶活測定體系優化的結果，采取pH 7.5，底物濃度100μmol/L，溫度25℃水浴孵育30min，檢測FOMT活性。圖8為不加類黃酮底物的空白實驗，酶液中SAH含量較低，檢測不到數值。色譜圖圖9～圖11分別為以槲皮素、山奈酚、異鼠李素為底物的FOMT活性反應生成物SAH測定的HPLC圖譜。不同底物樣品FOMT活性測定比較結果見表1。

圖8 空白實驗(不加類黃酮底物)樣品的HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of blank test sample (without flavonoid substrates)

圖9 槲皮素為底物的FOMT活性反應生成物SAH色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of SAH derived from FOMT catalytic reaction on the quercetin

表1 三種底物FOMT相對活性比較(n=3)Table 1 Comparative of FOMT activity on there different substrates(n=3)

由表1可以得出，不同反應底物的FOMT活性表現有所差異:山奈酚與異鼠李素差異不顯著，槲皮素分別與山奈酚和異鼠李素都有顯著性差異，槲皮素為底物的酶活性顯著較低。說明FOMT對山奈酚和異鼠李素的底物親和性顯著高于槲皮素。

圖10 山奈酚為底物的FOMT活性反應生成物SAH色譜圖Fig.10 HPLC chromatogram of SAH derived from FOMT catalytic reaction on the kaempferol

圖11 異鼠李素為底物的FOMT活性反應生成物SAH色譜圖Fig.11 HPLC chromatogram of SAH derived from FOMT catalytic reaction on the isorhamnetin

3 討論

本研究首次采用HPLC方法測定銀杏葉片中FOMT酶活性，所獲得的HPLC方法快速、靈敏、準確、重現性好，精確度良好，耗費藥品較少，節省成本，可有效測定FOMT活性反應產物的含量，從而更加準確地測出酶的活性。由于酶活反應受到反應溫度，反應濃度，試劑等的影響，本實驗對酶活反應體系進行優化，使得酶活測定的結果更具代表性。選擇山奈酚、槲皮素和異鼠李素作為反應底物能夠更好地說明FOMT的活性，因為這三種底物是具有生物活性的黃酮苷元，也是GBE質量檢測的主要指標。本研究為探究銀杏雄株葉片類黃酮含量與FOMT活性相關性奠定基礎，從而為銀杏優質葉用資源的選育提供理論依據和技術支撐。

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Analysis on flavonoid O－methyltransferase activity in Ginkgo by high performance liquid chromatography

ZHONG Yue－ming1，ZHANG Chuan－li2，CHEN Peng1，*，SHEN Dan－hong1，WU Qiu－yue1，ZHOU Chang－yuan1
(1.College of Horticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China; 2.College of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)

To research and geta technique and method fordetermination on theactivityofflavonoid O－methyltransferase(FOMT)，a key－enzyme of flavonoid biosynthesis in Ginkgo leaves，by RP－HPLC for the first time.The adult leaves of male plants，were obtained from Ginkgo germplasm resources garden of Yangzhou university，then that were used to extract the crude enzyme solution.Based on the principle of S－adenosyl－L－homocysteine(SAH)derived from FOMT catalytic reaction and the correlationship between content and peak area of SAH，the relative activities of FOMT on the different substrates such as kaempferol，quercetin and isorhamnetin，were determined，the standard curve detected by optimized high performance liquid chromatography(HPLC) system in which there was a significant linear relationship within the range of 1.5～20μg/mL，RSD=2.1%(n=5)，so the optimized system for assaying FOMT activity had been established.FOMT activities of the different substrates showed different，kaempferol and isorhamnetin significiantly higher than quercetin.This HPLC system for determination on FOMT activity could be considered as a method which was accuracy，fastness，reliability and high sensitivity.

Ginkgo;male plant;leaf;flavonoidO－methyltransferase(FOMT)activity;high performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002－0306(2012)08－0095－05

2011－07－20 *通訊聯系人

仲月明(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:銀杏保健藥用資源的開發利用。

國家農業綜合開發項目(GH32311002);江蘇省林業三項工程項目(lxsx［2008］02)。