超聲熱浸-紫外分光光度法測定蜂巢蜜中總黃酮含量

江津津，黎海彬，韓 明，黃建初，王 英

(廣州城市職業學院建筑環境與食品工程學院，廣東廣州510405)

超聲熱浸-紫外分光光度法測定蜂巢蜜中總黃酮含量

江津津，黎海彬，韓 明，黃建初，王 英

(廣州城市職業學院建筑環境與食品工程學院，廣東廣州510405)

建立了一種快速提取測定蜂巢蜜中總黃酮含量的方法—超聲熱浸紫外分光光度法。蜂巢蜜、蜂膠、蜂皇漿、椴樹蜜的超聲熱浸提取液用聚酰胺柱層析去除雜質干擾后，用分光光度法在360nm波長處測定總黃酮含量。此方法回收率均在90%以上，變異系數均低于2%，具有良好的準確度。與傳統方法相比，該方法具有試劑用量少，操作簡單等優點，蜂巢蜜中總黃酮含量為14.97mg/100g，雖僅為蜂膠產品總黃酮含量的0.87%，但與其它蜂產品進行比較，總黃酮含量至少高出蜂王漿、洋槐蜜、椴樹蜜一倍。蜂巢蜜作為一種新面市的保健食品，在黃酮類活性物質含量上表現出更高的保健價值。

蜂巢蜜，總黃酮，超聲熱浸提

1.1 材料與設備

蜂巢蜜、洋槐蜜、椴樹蜜、蜂膠、蜂王漿 廣東養生源蜂業有限公司;甲醇，苯(分析純)，超純水，蘆丁(生化試劑，≥99%)。

YJ－3200 DTD型超聲清洗儀、ALC－210.4型電子分析天平、恒溫水浴鍋、層析柱 廣州精科化玻儀器有限公司定制;循環水真空泵 西安常儀儀器設備有限公司;超純水儀 美國Millipore公司;UV1100型紫外－可見分光光度計，JJ－2型高速組織搗碎機。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 原料除雜后置冰箱，于0～6℃冷藏后取出，立即粉碎，備用。

1.2.2 蘆丁標準溶液配制 取5.0mg蘆丁，加甲醇溶解并定容至100mL，即得濃度為50μg/mL蘆丁標準儲備液。

1.2.3 蜂膠與蜂王漿中總黃酮的提取 分別稱取蜂膠與蜂王漿樣品0.5g和5g置于250mL燒杯中，用甲醇溶解后定容至100mL，充分混勻后倒回250mL燒杯中于40℃下超聲提取20min，靜置［8］，用移液管吸取上清液1.0mL于玻璃蒸發皿中，加入5.0mL乙醇及1g聚酰胺粉，用玻璃棒混勻吸附，于60℃水浴上揮去甲醇，先吸取10.0mL苯液將蒸發皿上的聚酰胺粉混勻，然后一并轉入關閉活塞的層析柱中，再分別吸取5.0mL苯液清洗玻璃蒸發皿，最后也將苯液和殘留聚酰胺粉一并轉入層析柱中，20mL苯液分3次完成。15min后開啟層析柱活塞，棄去苯液并關閉層析柱活塞，取下平底燒瓶，將25mL容量瓶裝于層析柱下方。吸取20mL甲醇，分3次清洗玻璃蒸發皿，再將甲醇轉入層析柱中，15min后開啟層析柱活塞將黃酮洗脫于25mL容量瓶中，用甲醇定容至25mL。

1.2.4 蜂巢蜜與其他蜂蜜中總黃酮的提取 稱量20g粉碎過篩后的蜂蜜，放入250mL燒杯中，加入不同濃度甲醇溶液，放于超聲波清洗器內超聲提取，設定提取時間，進行四因素三水平的正交實驗，以確定最佳超聲熱浸提參數。將提取液和醇不溶物抽濾分離，用移液管吸取上清液1.0mL于玻璃蒸發皿中，后續柱層析操作與1.2.3中相同。

1.2.5 單因素實驗設計 為考察熱浸提溫度、提取時間、醇濃度、料液比等主要影響因素對樣品總黃酮提取的影響。按照表1設計單因素實驗。

表1 單因素實驗表Table 1 One－factor experimental design

1.2.6 正交實驗設計 以黃酮測定含量為考核指標，以影響測定含量的4個因素變量:提取溫度(A)、提取時間(B)、甲醇濃度(C)和料液比(D)，設計正交實驗因素水平表(表2)，進行L9(34)正交實驗，確定超聲波提取最佳工藝條件。

表2 正交實驗因素水平表Table 2 Orthogonal experimental design

1.2.7 樣品中總黃酮含量的測定 標準曲線的制作［5］:精確稱取蘆丁對照品5.0mg，加甲醇溶解，并定容至100mL，此對照溶液含蘆丁對照品50μg/mL。取6個10mL容量瓶，分別準確吸取該蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于10mL容量瓶中，加入甲醇補足至10.0mL，搖勻，放置一刻鐘后，置于1cm比色皿中于波長360nm處測定吸光值，繪制標準工作曲線，計算回歸方程。

樣品測定:將用層析柱洗脫出來的已用甲醇定容至25mL的蜂巢蜜、蜂王漿、洋槐蜜、椴樹蜜及蜂膠總黃酮提取液置于1cm比色皿中于波長360nm測定其吸光值，并用標準曲線法定量。

式中:X2:試樣中總黃酮的含量(mg/100g);A:由標準曲線算得被測液中黃酮量(μg);V2:試樣定容總體積(mL);V1:吸取的上清液體積(mL);M3:試樣質量(g)。

2 結果與討論

2.1 蜂巢蜜甲醇浸提單因素實驗結果

在浸提過程中，溫度是影響最終提取物黃酮含量的重要因素。甲醇濃度固定為≥95%的條件下，分別在20～40℃溫度范圍內隨著溫度的升高，蜂巢蜜中測定的黃酮含量也隨之增加。溫度≥40℃時對黃酮含量的影響不大，考慮蜂巢蜜中蜂蠟的溶解度和能耗方面的問題，確定提取溫度在40℃左右進行。

隨著提取時間的延長，測定含量變化緩慢無顯著增長，所以總黃酮的提取時間選擇在8h內較為合適。

不同料液比對蜂巢蜜進行提取實驗結果表明，隨著料液比的增大，測定的黃酮含量無明顯增大，結合GB/T 24283－2009中的提取方法，采用將1∶10范圍內的醇提物直接定容到100mL容量瓶。

在提取時間不超過8h，提取溫度恒溫在40℃的條件下，料液比1∶10，考察不同醇濃度對測定的黃酮含量變化情況。結果表明隨著醇濃度的增加，測定的總黃酮含量也逐漸增大，所以確定提取用甲醇濃度設定在80%以上。

2.2 蜂巢蜜超聲熱浸提正交實驗結果

表3 L9(34)實驗結果Table 3 The results of L9(34)tests

由表3的極差R值大小反映出各因素對蜂巢蜜總黃酮提取率大小影響順序為提取溫度＞料液比＞醇濃度＞提取時間，即超聲波提取蜂膠過程中，提取溫度和料液比為主要影響因素，超聲波熱浸提蜂巢蜜的最佳工藝應為A1B2C3D1，為進一步確定蜂巢蜜中總黃酮的提取率，對最佳工藝進行驗證實驗，最后得出最佳工藝參數:提取溫度為40℃，甲醇濃度≥95%，料液比為1∶5，超聲波提取時間20min，這最佳工藝條件下黃酮提取率為15%，高于表3中出現的任一提取率，說明經過正交實驗方案優化得到的提取條件是科學的。超聲輔助溶劑熱浸提法操作簡便，收率高，成本明顯較超臨界萃取法等其他方法低，操作時間短［7－12］。

2.3 蘆丁標準曲線

根據吸光度數據繪制標準曲線，如圖2所示，對數據進行直線回歸得方程:y=0.0277x－0.0031，R2= 0.9999。本實驗選用的測定方法源自國標 GB/T 24283－2009，在國標基礎上有所改良［13－15］，所得的標準工作曲線線性良好。所以蜂巢蜜中總黃酮含量的測定以紫外分光光度法為優。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Standard curve of Rutin

2.4 精密度與回收率

隨機取同一品種的蜂產品勻漿混勻，做7次平行實驗，對其進行誤差分析，結果表明各類樣品的標準差均≤0.07，變異系數均低于2%，表明實驗具有很好的重復性，精密度高。取已知總黃酮含量的樣品做回收率實驗，分別加入蘆丁標準品0.010g和0.020g，加標后的測定值與本底值的差與加標量相比，得到的回收率均≥90%，說明測定方法可靠。

2.5 蜂巢蜜與其他蜂產品中總黃酮含量的比較

實驗測得蜂巢蜜中總黃酮含量為14.97mg/100g，與蜂膠總黃酮含量1730.39mg/100g相比有很大差距，僅為蜂膠產品總黃酮含量的0.87%。與洋槐蜜、椴樹蜜、蜂王漿進行比較(圖3)，則含量明顯高于洋槐蜜的4.64mg/100g、蜂王漿的7.67mg/100g和椴樹蜜的2.50mg/100g。

圖3 不同蜂產品中總黃酮含量比較Fig.3 Contents of total flavone of all samples

3 結論

3.1 本研究采用超聲波輔助甲醇熱浸提的方式提取蜂產品中的黃酮類化合物，提出了蜂巢蜜中總黃酮提取的新方法。

3.2 本研究根據總黃酮類物質在紫外波長360nm處有最大吸收的原理，與其他檢測方法相比，省去用硝酸鋁或三氯化鋁溶液作顯色劑顯色的步驟［15－17］，通過在紫外波長360nm處直接測定吸收值并用工作曲線定量來完成測定。針對不同的蜂產品中所含黃酮類物質的差異，提出了總黃酮測定的快捷方法，方法可靠且有創新。

3.3 蜂巢蜜作為一種新面市的保健食品，總黃酮含量比一般蜂蜜和蜂王漿至少多近1倍，在黃酮類活性物質含量上表現出更高的保健價值。

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Ultrasonic sound hot extract－ultraviolet spectrophotometric determination of total flavone in comb honey

JIANG Jin－jin，LI Hai－bin，HAN Ming，HUANG Jian－chu，WANG Ying
(College of Building Environment and Food Engineering，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou 510405，China)

Ultrasonic sound hot extract coupled with ultraviolet spectrophotometric was used to determinatate the total flavone in comb honey.Comb honey，propolis，royal jelly and linden honey were treated with polyamind column chromatography first to remove the impurities，then treated with methanol extract and ultrasonic sound hot extract. The detection method of total flavone was spectrophotometric method performed at 360nm.The mean spike recovery rates of the established method for total flavone in all samples were above 90%with a coefficient of variation of less than 2%.This method displayed excellent precision，had many advantages over the conventional method，such as less reagent consumption and ease of operation.The content of total flavone in comb honey was 14.97mg/100g，It was only 0.87%of that of propolis，but compared with some bee products，the content was nearly doubled.As a new healthy food，comb honey had digher value on total flavone.

comb honey;total flavone;ultrasonic sound hot extract

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0092－03

蜂巢蜜俗稱“蜂窩蜜”，是由蜂巢和蜂蜜兩部分組成的一種成熟蜜，也稱“封蓋蜜”。它集蜂膠、蜂王漿、花粉、蜂蜜、蜂蠟等天然營養成分為一體，被譽為蜜中之極品［1－2］。黃酮類化合物被證實具有抗炎癥、抗過敏、抗感染、抗腫瘤等功效［3－4］，國家衛生部和食品藥品監督管理局將總黃酮作為蜂膠保健食品的標志性成分指標進行檢測和鑒定，同時列入產品標準［5－6］。但關于蜂巢蜜中總黃酮的提取與含量測定的研究至今未見報道。

1 材料與方法

2011－06－29

江津津(1977－)，女，博士，講師，主要從事食品科學方面的研究。

廣東省教育部產學研結合項目(2010B090400113);廣州市教育系統創新學術團隊項目(200915)。