低溫灌腸制品中苦瓜皂甙抑菌模型的建立

王玉田，張麗艷，張國瑩

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001；2.本溪市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，遼寧本溪117000）

低溫灌腸制品中苦瓜皂甙抑菌模型的建立

王玉田1，張麗艷2，*，張國瑩2

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001；2.本溪市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，遼寧本溪117000）

用Gompertz方程對低溫灌腸制品冷藏期的特定菌生長曲線進(jìn)行擬合，模擬Ratkowsky方程腐敗菌生長動力學(xué)溫度模型，建立低溫灌腸制品中苦瓜皂甙抑菌模型，對苦瓜皂甙抑菌模型進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗。結(jié)果表明，修正的Gompertz方程對接種后低溫灌腸制品中特定菌生長曲線擬合性較好。通過苦瓜皂甙抑制模型可得大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌可耐受的苦瓜皂甙最高濃度分別為212.735、186.103、170.251mg/kg。抑菌模型經(jīng)數(shù)學(xué)檢驗證明，模型的適用性、準(zhǔn)確性和擬合性均在可接受的范圍內(nèi)，有應(yīng)用價值。

苦瓜，皂甙，抑菌模型

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬肉（肥瘦比1∶3）、豬小腸衣、乳酸鈉、異抗壞血酸鈉、復(fù)合磷酸鹽、食鹽、淀粉、調(diào)味料 均市售；苦瓜皂甙 本實驗室提供；LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；TYGA液體培養(yǎng)基；菌種：埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、生孢梭菌 本實驗室提供。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；熱空氣消毒箱 北京六一儀器廠；超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；電熱手提式壓力蒸汽消毒器、電熱恒溫水浴鍋 北京瑞幫興業(yè)科技有公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒸煮香腸制作 將鮮肉去除污物、筋骨后。肥瘦分開，絞碎（絞肉過程中加入適量的冰屑以降低溫度），瘦肉加入400mg/kg異抗壞血酸鈉以及3.9%的食鹽，肥膘只添加3.0%的食鹽，置于（2±2）℃的范圍內(nèi)腌制24h。腌制完畢進(jìn)行斬拌，同時加入輔料及規(guī)定量的苦瓜皂甙，灌制后在恒溫爐（65~70℃）中烘烤50min，放入水浴鍋（95℃）內(nèi)，溫度逐漸降至80~85℃后，加熱50min，出鍋后用白砂糖熏制50min后，用市售保鮮膜包裝，另做一個不加苦瓜皂甙的空白對照，一同冷藏保存。

1.2.2 細(xì)菌接種 不同苦瓜皂甙添加量的四組蒸煮香腸（0、30、60、120mg/kg）冷藏前每組分為三份，除對照外分別接種埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌。細(xì)菌接種均采用針管注射法，參照Fenlon[6]等、Desmarcherlier[7]等和Birzele[8]等的方法。樣品接種量均為1.5×103~1.5×104cfu/g。

1.2.3 細(xì)菌計數(shù) 在蒸煮香腸冷藏期間，每隔3d隨機(jī)取樣，參照GB/T 4789分別測定菌落總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌（參照Yetim等[9]和高尚先等[10]的方法）的數(shù)量。

1.2.4 細(xì)菌生長的動力學(xué)模型和參數(shù)估計（一級模型） 將每隔3d取樣得到的實驗數(shù)據(jù)，分別用修正的Gompertz方程描述生長動態(tài)，用非線性最小二乘法進(jìn)行擬合。估計生長曲線的最大比生長率（μmax）和遲滯期（λ）。修正的Gompertz方程如下：

式（1）中：t為時間（d）；N（t）是t時的微生物數(shù)量[lg（cfu/g）]；N0是t=0時的初始微生物量[lg（cfu/g）]；Nmax是增加到穩(wěn)定期時最大微生物數(shù)量[lg（cfu/g）]；μmax是微生物生長的生長率（d-1）；λ是微生物生長的遲滯期（d）；t是時間。

1.2.5 苦瓜皂甙抑菌模型的建立（二級模型） 模擬溫度對微生物生長影響的動力學(xué)模型Ratkowsky方程，建立苦瓜皂甙抑菌模型，用非線性最小二乘法進(jìn)行擬合。Ratkowsky方程如下：

式（2）、（3）中，N是苦瓜皂甙濃度（mg/kg），Nmax和Nmaxλ是一個假設(shè)概念，指的是微生物沒有代謝活動時的苦瓜皂甙濃度，即此時微生物生長率為零、遲滯期為無限長，b為常數(shù)。

1.2.6 苦瓜皂甙抑菌模型的可靠性評價 模型的適用性和可靠性需要經(jīng)過數(shù)學(xué)評價才能推廣到實際應(yīng)用[11]。將建立的苦瓜皂甙抑菌模型對目標(biāo)菌生長參數(shù)（μmax和λ）的預(yù)測值，與蒸煮香腸中目標(biāo)菌生長曲線的生長參數(shù)（μmax和λ）的估計值進(jìn)行比較，應(yīng)用平方根誤差（RMSE）、Baranyi[11]和Ross[12]等報道的準(zhǔn)確因子（Af）和偏差因子（Bf），進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗，評價建立的苦瓜皂甙抑菌模型的可靠性。偏差因子用來檢驗預(yù)測值的上下波動幅度，即偏差度；準(zhǔn)確因子用來衡量預(yù)測值和實測值之間的差異，即準(zhǔn)確度。

式（4）~式（6）中，obs為用修正的Gompertz方程擬合蒸煮香腸中特定菌生長曲線的生長參數(shù)μmax或λ觀測值（一級模型）；pred為用建立的苦瓜皂甙抑菌模型對μmax或λ的預(yù)測值（二級模型）。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌生長的動力學(xué)模型和參數(shù)估計（一級模型）

圖1 冷藏期間不同苦瓜皂甙添加量的蒸煮香腸中菌落總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的數(shù)量變化情況Fig.1 The counts of aerobic bacteria，coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogen-es of cooked sausage with different saponins additions during cold storage

不同苦瓜皂甙添加量的香腸在冷藏期間的菌落總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌數(shù)目（如圖1）。苦瓜皂甙的抑菌作用隨著添加量的增加而增強(qiáng)，在整個冷藏期間（0～30d）供試菌的生長均受到抑制。苦瓜皂甙添加量為120mg/kg的處理組與未添加組之間比較，在30d時，大腸菌群的菌數(shù)差異顯著（p＜0.05），金黃色葡萄球菌和厭氧菌生孢梭菌菌數(shù)差異極顯著（p＜0.01）。

應(yīng)用修正的Gompertz方程對蒸煮香腸冷藏期間的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌生長曲線進(jìn)行擬合，對生長曲線的生長率（μmax）和遲滯期（λ）進(jìn)行參數(shù)估計見表1。結(jié)果表明苦瓜皂甙的添加量越大，三種菌的生長率越低、遲滯期越長，這與用觀測值繪制的生長曲線結(jié)果相同，表明苦瓜皂甙的顯著抑菌作用。同時，修正的Gompertz方程能夠較好的擬合不同條件下生孢梭菌的生長狀況，這與Graham等[13]的研究結(jié)果一致。

表1 應(yīng)用Gompertz方程擬合求得的特定菌生長曲線的生長參數(shù)Table 1 The parameters growth rate（μmax）and lag time（λ）of coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogenes obtained from modified Gompertz function

2.2 苦瓜皂甙抑菌模型的建立（二級模型）

應(yīng)用式（4）和（5）擬合苦瓜皂甙抑制大腸菌群、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的二級模型。結(jié)果見圖2、圖3和圖4。得到苦瓜皂甙抑菌的二級方程：大腸菌群如式（6）和（7），金黃色葡萄球菌如式（8）和（9），生孢梭菌如式（10）和（11）。

圖2 苦瓜皂甙抑制大腸菌群的二級模型Fig.2 Secondary model of Coliform bacteria inhibition from Momordica saponins

結(jié)果表明，苦瓜皂甙抑菌模型的擬合性高低順序為：金黃色葡萄球菌＞大腸菌群＞生孢梭菌。Nmax參數(shù)值指微生物沒有代謝活動時的苦瓜皂甙的濃度，即在此濃度時生長率為零、遲滯期為無限長，因此三種菌耐受苦瓜皂甙的最高濃度分別為：大腸菌群是212.735mg/kg；金黃色葡萄球菌是186.103mg/kg；生孢梭菌是195.714mg/kg。

圖3 苦瓜皂甙抑制金黃色葡萄球菌的二級模型Fig.3 Secondary model of Staphylococcus inhibition from Momordica saponins

圖4 苦瓜皂甙抑制生孢梭菌的二級模型Fig.4 Secondary model of C.sporogenes inhibition from Momordica saponins

2.3 苦瓜皂甙抑菌模型的可靠性評價

2.3.1 驗證用蒸煮香腸中特定菌的生長參數(shù)估計與預(yù)測 分別制作三組蒸煮香腸（苦瓜皂甙含量45、75、110mg/kg），其主要原輔料組成與建立抑菌模型的實驗樣品一致，每組分為三份，分別接種埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌。接種生孢梭菌的實驗組需經(jīng)過真空包裝。細(xì)菌接種均采用針管注射法（同方法1.2.2），相同條件下取樣檢測菌數(shù)（同方法1.2.3），通過MicroFit軟件擬合生長曲線，并對μmax和λ進(jìn)行參數(shù)估計，結(jié)果見表2。

表2 應(yīng)用修正的Gompertz方程擬合求得的用于驗證的實驗樣品中供試菌的生長參數(shù)Table 2 The parameters growth rate（μmax）and lag time（λ）of coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogenes obtained from modified Gompertz function

用建立的苦瓜皂甙抑菌模型（二級模型）對驗證用蒸煮香腸中特定菌生長參數(shù)μmax和λ進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如表3所示。驗證用蒸煮香腸中，觀測到的特定菌的生長率（μmax）比抑菌模型預(yù)測值低，而觀測到的特定菌的遲滯期（λ）比抑菌模型預(yù)測值高，這說明建立的抑菌模型屬于Fail-safe類型。如果將建立的預(yù)測模型應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，將會出現(xiàn)“預(yù)測結(jié)果比實際情況嚴(yán)重”的現(xiàn)象，大大保證了產(chǎn)品的安全性，這樣的模型可以放心使用。

表3 應(yīng)用建立的苦瓜皂甙抑菌模型對驗證用蒸煮香腸的特定菌生長參數(shù)預(yù)測Table 3 Predictions of growth rate（μmax）and lag time（λ）of coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogenes obtained from secondary model Momordica saponins inhibition

2.3.2 苦瓜皂甙抑菌模型數(shù)學(xué)檢驗 對苦瓜皂甙抑菌模型進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗結(jié)果見表4，對生長率的預(yù)測RMSE都低于1.0，而遲滯期的RMSE較高，由此說明生長率的預(yù)測準(zhǔn)確性高。偏差因子（Bf）檢驗結(jié)果表明，三種特定菌的Bf值都在1.0左右，可見苦瓜皂甙抑菌模型屬于可接受類型。準(zhǔn)確性因子（Af）值越大表示平均準(zhǔn)確性越低，而Af值等于1表示預(yù)測值與觀測值之間完全吻合。結(jié)果顯示，大腸菌群和金黃色葡萄球菌的Af值較低，而生孢梭菌的Af值相對較高，表明建立的苦瓜皂甙抑菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的模型準(zhǔn)確性較高。本文建立的預(yù)測模型經(jīng)檢驗適用性好，擬合性好。食品處于實際環(huán)境中其結(jié)構(gòu)在某種程度上對微生物的生長行為產(chǎn)生影響，環(huán)境的復(fù)雜性遠(yuǎn)高于實驗條件下的研究，因此抑菌模型計算出來的值比實際食品環(huán)境中偏大。

表4 苦瓜皂甙抑菌模型的數(shù)學(xué)檢驗Table 4 Mathematical validations of secondary model Momordica saponins inhibition

3 結(jié)論

苦瓜皂甙作為天然植物防腐劑，對金黃色葡萄球菌、大腸菌群和生孢梭菌均有明顯抑制作用。修正的Gompertz方程對香腸冷藏期間的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌生長曲線的擬合性較好。通過Ratkowsky平方根經(jīng)驗?zāi)Ｐ蛿M合的抑菌模型得到三種菌耐受苦瓜皂甙的最高濃度為212.735、186.103、170.251mg/kg。對苦瓜皂甙抑菌模型進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗，模型的適用性、準(zhǔn)確性和擬合性均在可接受的范圍內(nèi)，苦瓜皂甙抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的模型準(zhǔn)確性較高。

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Establishment of bacteria inhibition model by saponins in lowtemperature sausage

WANG Yu-tian1，ZHANG Li-yan2，*，ZHANG Guo-ying2
（1.Food Science and Technology College，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Product Quality Supervision and Inspection Institution of Benxi，Benxi 117000，China）

The growth curves of certain bacteria were fitted by modified Gompertz，then establishment and validation of bacteria inhibition model from saponins in low-temperature enema products by forecast microbiology.The investigation of establishment and validation of bacteria inhibition model from saponins in low-temperature enema products indicated that the growth curves of coliform bacteria.The highest enduring concentrations of Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Clostridium sporogenes to saponins were lower than 212.735，186.103，170.251mg/kg，respectively.The result of evaluation of mathematical parameters indicated that root-mean-squares error（RMSE），bias factor（Bf）and accuracy factor（Af）were within acceptable range and bacteria inhibition model was value for application in low-temperature enema products.

Momordica charantia L；saponins；bacteria inhibition model

TS251.6+5

A

1002-0306（2012）03-0117-04

苦瓜（Momordica Charantia L.）為葫蘆科苦瓜屬植物，性味苦寒，具有清熱解毒、滋養(yǎng)強(qiáng)壯等功效[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，苦瓜具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用。并且苦瓜皂甙對高血糖有協(xié)同預(yù)防作用[2]。國內(nèi)外研究[3-5]已證實，苦瓜汁具有免疫調(diào)節(jié)、廣譜抗菌作用，苦瓜種仁蛋白和苦瓜皂甙對啤酒酵母菌、米曲霉菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用。為進(jìn)一步開發(fā)利用苦瓜資源，本實驗對苦瓜皂甙在低溫灌腸制品中的防腐作用做了一些研究并建立抑菌模型，以討論其作為天然防腐劑的前景。

2011－03－14 *通訊聯(lián)系人

王玉田（1953-），男，碩士，教授，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全工程。

遼寧省工程中心基金項目（2010402004）。