蒙古奶酪凝塊中酵母菌的分離鑒定

王文磊，魯永強，蘇東海，武建新

（1.包頭輕工職業技術學院，內蒙古包頭014035；2.北京電子科技職業學院，北京100029）

蒙古奶酪凝塊中酵母菌的分離鑒定

王文磊1，魯永強1，蘇東海2，武建新1

（1.包頭輕工職業技術學院，內蒙古包頭014035；2.北京電子科技職業學院，北京100029）

從蒙古奶酪凝塊中分離檢定酵母菌，既可保護內蒙古草原原始微生物資源，同時為奶酪的工業化生產培養國產菌種。從蒙古奶酪凝塊中使用經典酵母菌分離鑒定方法得到12株酵母菌，經鑒定分別是4株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），3株馬克斯克魯維酵母 （Kluyveromyces marxianus），2株班圖酒香酵母（Brettanomyces custersianus），3株膜醭畢赤氏酵母（Pichia membranaefacienf）。

蒙古奶酪，酵母菌，分離，鑒定

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2%美蘭染色液，5%孔雀綠水溶液，0.5%兼性藏紅花；林格氏碘液 碘5g，碘化鉀10g，蒸餾水100mL；甲液 對氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸溶液100mL；乙液 ɑ-萘胺0.5g，5mol/L醋酸溶液100mL；重氮基藍液B液 0.1mol/L三羥輕甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH7.0，每毫升含1mg；麥芽汁培養基（1號培養基）

麥芽汁300mL，酵母膏3g，蛋白胨5g，乳糖10g，瓊脂20g，蒸餾水700mL，pH6.0；馬鈴薯培養基（PDA） 馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂1.5～2g，蒸餾水100mL，自然pH；Gorodkowa瓊脂培養基 葡萄糖1g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL；麥芽汁-酵母膏-葡萄糖-蛋白胨瓊脂培養基 干麥芽粉3g，干酵母粉3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，制成液體培養基，固體培養基加瓊脂20g；玉米粉瓊脂培養基[2]黃玉米粉12.5g，蒸餾水300mL，攪勻置60℃維持1h，過濾，濾液的體積為300mL，加3.8g瓊脂；McClary醋酸瓊脂培養基 葡萄糖0.1%，KCl 0.18%，酵母浸粉0.25%，三水醋酸鈉0.28%，瓊脂1.5%，蒸餾水1000mL；糖發酵基礎培養液 按照參考文獻[3]中配置；硝酸鹽培養基 硝酸鉀0.2g，蛋白胨5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.4。以上培養基在使用前需經過高壓蒸汽滅菌，121℃，15min；實驗樣品 從內蒙古牧區采樣點收集的蒙古奶酪凝塊共5份。采樣時，采集發酵結束煮熬之前的凝塊（半成品），迅速放入事先準備好的無菌瓶中密封，置4℃冰柜中備用。

超凈工作臺、恒溫培養箱（溫度范圍20～100℃）、高速冷凍離心機（TGL-16G-A） 上海精密儀器儀表有限公司；普通光學顯微鏡OLYMPUS-CO11 日本奧林巴斯公司。

表1 采樣及編號Table 1 Sample and number

1.2 酵母菌鑒定

圖1 酵母菌鑒定程序[6]Fig.1 Yeast identification program

1.2.1 酵母菌的分離純化 菌種的分離進行了兩次，一次在取樣現場進行，培養溫度選用當地當時室內溫度。另一次將樣品帶回實驗室進行無菌操作。用接種環分別挑取樣品用劃線的方式接種于1號麥芽汁瓊脂培養基上。培養溫度選擇15、20、25、30℃四個溫度梯度（涵蓋了大多數酵母菌生長的溫度范圍），培養時間1～3d。之后挑取酵母菌可疑菌落，美蘭染色30s后，顯微鏡觀察其形態，將確認為酵母菌的菌落接種于1號培養基上進行純化。純化兩次后，菌種穿刺接種到1號半固體培養基上，25℃培養36h后置于4℃冰箱備用。（如無特殊說明，以下實驗所用菌種均取自上述1號半固體培養基保存的菌種）。

1.2.2 酵母菌鑒定程序 根據巴尼特JA《酵母菌的特征與鑒定手冊》[2]，Kurtzman CP，Fell JW《The Yeasts，a Taxonomic Study》[4]，周德慶編《微生物學實驗手冊》進行鑒定[5]。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離結果

從五個樣品中分別分離出12株酵母菌，如表2所示。其菌落形態如表3所示。

表2 分離酵母菌編號Table 2 Isolation of yeasts

表3 酵母菌落形態結果Table 3 Yeast colony morphology results

2.2 酵母菌屬的鑒定結果

表4 酵母菌細胞形態和繁殖方式Table 4 Yeast cell morphology and reproductive modes

酵母菌細胞形態和繁殖方式如表4所示。

分離出的12株酵母菌為圓形、橢圓形和小橢圓形，沒有臘腸形和瓜子形等長形。有的有假菌絲，有的沒有，有的出現有隔菌絲。無性繁殖都為芽殖，除XB3和HX3外都產生子囊。12株酵母菌都沒有擲孢子出現。

XB1、XL1、HX2、EW2細胞形態為橢圓形或小橢圓形，可見假菌絲，但數量較少；無性繁殖為芽殖，有性繁殖產生子囊，并永久性存在，子囊中有1～7個子囊孢子，多見1～4個，孢子形狀圓形、橢圓形和卵圓形；無擲孢子產生；判斷為酵母屬。XB2、XL2、BS1細胞形態為圓形或橢圓形，少有假菌絲；無性繁殖為芽殖；有性繁殖產生子囊，子囊中有1～60個圓形或橢圓形子囊孢子，當孢子成熟放出后，子囊即消失；無擲孢子產生；判斷為克魯維酵母屬。XB3、HX3均無子囊孢子，無擲孢子生成，無性繁殖為芽殖，有時有假菌絲，細菌形態橢圓形或小橢圓形；屬于酒香酵母屬。EW1、HX1、BS2均為橢圓形，產生假菌絲；產生子囊，子囊孢子1～8個禮帽形、土星形；無擲孢子；屬于畢赤氏酵母屬。

2.3 酵母菌種的鑒定結果

酵母菌生化反應實驗結果：

以下鑒定基于巴尼特J A《酵母菌的特征與鑒定手冊》[2]，《The Yeasts，a Taxonomic Study》第四版[7]，KurtzmanCP，FellJW《TheYeasts，aTaxonomicStudy》[4]提供的鑒定依據進行。

表5 酵母菌糖發酵實驗結果Table 5 Experiment results of yeast fermentation

表6 酵母菌碳同化實驗結果Table 6 Experiment results of yeast carbon assimilation

表7 酵母菌氮同化實驗結果Table 7 Experiment results of yeast nitrogen assimilation

觀察生化實驗結果發現，所有待測菌株在硝酸鹽還原實驗、類淀粉物質生成實驗、脲酶實驗和DBB實驗中都為陰性反應。XB1、XL1、HX2和EW2四株菌全部發酵葡萄糖和半乳糖，不發酵乳糖和纖維二糖，部分發酵蔗糖、麥芽糖、棉籽糖。不同化密二糖、D-阿拉伯糖、赤蘚糖、甘露醇、肌醇、檸檬酸，部分同化可溶性淀粉、乙醇、琥珀酸和乳酸。在單一氮源培養基中不同化硝酸鹽、尸胺和亞硝酸鹽，部分同化賴氨酸。結合細胞形態和繁殖方式的鑒定結果，判斷為酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

XB2、XL2、BS1幾乎可發酵所有被檢糖。在碳同化實驗中，在密二糖、可溶性淀粉、D-阿拉伯糖、赤蘚糖和肌醇中不生長，在甘露醇和檸檬酸中部分生長，在乙醇、琥珀酸和乳酸中全部生長。結合細菌形態和繁殖方式的鑒定結果，判斷為克魯維酵母屬的馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）。

XB3、HX3幾乎不發酵所有被檢糖，只有D-葡萄糖經過延期1周后發酵。在碳同化實驗中，也表現冷淡，大部分碳水化合物不生長，只有乙醇全部生長，琥珀酸和乳酸部分生長。在單一氮源培養基中硝酸鹽和亞硝酸鹽氮源不生長，在尸胺和賴氨酸中部分生長。結合細胞形態和繁殖方式的鑒定結果，判斷為酒香酵母屬的班圖酒香酵母（Brettanomyces custersianus）。

EW1、HX1、BS2三株菌在發酵實驗中除D-葡萄糖部分發酵外不發酵其他被檢糖。在碳源同化實驗中可同化乙醇，在琥珀酸和乳酸中部分生長，其他被檢碳水化合物均不生長。氮源同化實驗中，在含尸胺和賴氨酸培養基上可生長，硝酸鹽和亞硝酸鹽培養基上不生長。另外，這三株菌的液體培養基發酵液表面形成膜醭，發酵液渾濁，菌體聚集在試管底部，只要輕輕振蕩就會快速漂起。而其他的液體培養基發酵液都沒有形成膜醭，發酵液清澈，菌體沉淀在底部，劇烈搖動才能將菌體浮起并迅速落下。再結合細胞形態和繁殖方式的鑒定結果，判斷為畢赤氏酵母屬的膜醭畢赤氏酵母（Pichia membranaefacienf）。

3 結論

本實驗從內蒙古錫林郭勒盟、鄂爾多斯市、呼和浩特市和包頭市周邊草原收集蒙古奶酪發酵液5份，覆蓋了內蒙古中、東部地區，采樣范圍具有代表性。經實驗，得出以下結論：從蒙古奶酪凝塊中得到12株酵母菌，經鑒定分別是4株釀酒酵母，3株馬克斯克魯維酵母，2株班圖酒香酵母，3株膜醭畢赤氏酵母。

[1]梁茂文.酵母菌在低酒精度乳制品生產及養殖業中的應用[J].山西農業科學，2009，37（2）：67-71.

[2]巴尼特J A.酵母菌的特征與鑒定手冊[M].胡瑞卿譯.青島：青島海洋大學出版社，1990.

[3]倪慧娟.新疆地區和青海地區傳統發酵乳制品中酵母菌的生物多樣性[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2009.

[4]Kurtzman C P，Fell J W.The yeasts，a taxonomic study[M]. 4th edn.Amsterdam：Elsevier，Science B V，Amsterdam，1998.

[5]周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，1992.

[6]張積榮.酸馬奶中酵母菌的分離鑒定及發酵過程中乙醇含量變化的研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2007.

[7]Elsevier.Theyeasts，ataxonomicstudy[M].4thedn.Amsterdam：Elsevier，Science B V，Amsterdam，1998：360-367.

Isolation and identification of yeast in the Mongolian cheese clots

WANG Wen-lei1，LU Yong-qiang1，SU Dong-hai2，WU Jian-xin1
（1.Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014035，China；2.Beijing Vocational College of Electronic Science and Technology，Beijing 100029，China）

Clot test yeast were isolated from Mongolian cheese.It can protect the original microbial resources in Inner Mongolia grassland，and train cheese bacteria for domestic industrial production.Using the classic method isolation and identification of yeasts cheese clot from Mongolia to get 12 yeasts，which was identified four Saccharomyces cerevisiae，three Max Kluyveromyces，two Brettanomyces custersianus and three Pichia membranaefacienf respectively.

Mongolian cheese；yeast；separation；identification

TS201.2

A

1002-0306（2012）03-0149-04

蒙古奶酪是一種傳統的民族食品，是具有牧區特點的牧民非常喜歡的直接入口食品。其加工工藝如下：牛奶、馬奶或羊奶等哺乳動物鮮奶→倒入攪乳桶不斷攪拌提取奶油→桶中剩余脫脂乳放置于溫度較高處（一般25～35℃）自然發酵3～5d→當桶中脫脂乳變酸后，倒入鍋中煮熬，待酸奶呈現出豆腐形狀時稱為奶渣，將奶渣舀進紗布里擠壓除去水份→把奶渣放進模具或木盤中擠壓成形→根據喜好進行晾曬控制水分含量（也可不進行晾曬直接食用）→成品奶酪。蒙古奶酪制作過程使用內蒙古草原上的天然微生物自然發酵，是我國本土微生物的絕好來源。酵母菌在蒙古奶酪發酵過程中起著不可忽略的作用，尤其對于奶酪風味物質的生成貢獻突出。酵母菌發酵產生的風味物質主要有乙醇、酸類以及其他醇類物質，形成特有的酒花香味，既增加蒙古奶酪的凝固性，又有助于食物消化。同時酵母菌能夠產生多種水溶性維生素，進一步提高了蒙古奶酪的營養價值[1]。在發酵過程中，酵母菌和乳酸菌共同作用分解乳蛋白，降解乳糖生成氨基酸、乳酸、乙醇、有機酸和其他風味成分，賦予蒙古奶酪乳香、醇香的特點。綜上所述，本實驗具有以下意義：保護來自內蒙古草原的微生物資源；為奶酪加工用菌種完全國產化提供前提。

2011－03－15

王文磊（1978-），女，碩士，工程師，講師，研究方向：發酵乳制品。

生物技術在奶制品加工中的應用（PXM2011_014306_113565）。