貯藏“海沃德”獼猴桃中霉菌的分子鑒定及生物學特性的研究

段愛莉，雷玉山，高貴田，*，孫翔宇，梁 俊

(1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062; 2.陜西伯瑞獼猴桃研究院，陜西西安710062)

貯藏“海沃德”獼猴桃中霉菌的分子鑒定及生物學特性的研究

段愛莉1，雷玉山2，高貴田1，*，孫翔宇1，梁 俊1

(1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062; 2.陜西伯瑞獼猴桃研究院，陜西西安710062)

目的:分離與鑒定陜西省周至縣貯藏期腐爛“海沃德”獼猴桃果實中的霉菌，并對其生物學特性進行研究，為今后獼猴桃貯藏保鮮的研究提供理論依據;方法:通過形態觀察并結合分子鑒定，確定獼猴桃病原菌的種類;通過對其生長培養基、光照、溫度、pH、致死溫度和抗紫外能力等生物學特性研究，分析不同病原菌之間的生物學特性的差異。結果:從腐爛獼猴桃中共分離出 5株致病菌，鑒定為:Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum和Trichoderma longibrachiatum。生物學特性結果表明:在豆芽汁培養基上產孢量最大;連續光照條件下孢子產量最高，并且在溫度為30℃、pH為6.0～7.0時為產孢量最佳;致死溫度80℃以上且抗紫外能力在72.73%～92.45%之間。結論:陜西省周至縣“海沃德”獼猴桃貯藏期致病菌主要為青霉菌屬和木霉菌屬，生長pH和溫度范圍寬、致死溫度高、抗紫外能力較強。

獼猴桃;海沃德;霉菌;ITS;生物學特性

獼猴桃屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)植物，系呼吸躍變性果實，且為皮薄多汁的漿果，采后在常溫貯藏下極易軟化腐爛，損失率高。貯藏后期腐爛主要是由霉菌侵染而引起的，是影響獼猴桃果實生產的重要病害之一［1－2］。王雅等［3］通過對微生物的形態、培養特征及生物學特性的研究，鑒定出蘋果中的霉菌分別為青霉屬(Penicillium)、黑曲霉屬(Aspergillus)。多種水果病原真菌最初的鑒定分類都是從形態學上依據Rifai和Bissett的分類方法來進行，但隨著生物技術的進一步發展，分子生物學的鑒定方法被越來越多地應用于真菌的鑒定分類中［4－6］。大多數水果與蔬菜的致病菌在多種環境條件下生存能力極強，甚至同種菌的不同菌株在不同環境下所表現出來的性狀都存在很大的差異，這主要表現在對培養基的利用、對生長環境溫度及光照的適應性等方面［7］。因此，致病霉菌的生物學特性的詳細研究有其現實的意義。本文通過形態學和分子生物學對分離出的治病霉菌進行鑒定，同時進行生物學特性的測定，為今后研究獼猴桃生物保鮮奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃 陜西省周至縣霉爛“海沃德”獼猴桃;豆芽 陜西省華潤萬家超市;馬丁氏培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基PDA、察氏瓊脂培養基CA、蔗糖、葡萄糖 中國進出口商品檢驗技術研究所;真菌DNA提取試劑盒、UNIQ－10柱式PCR產物純化試劑盒、100bp plus DNA ladder buffer、2×Taq PCR Master Mix、MgCl2、ITS1、ITS4 上海生工生物工程有限公司。

超凈工作臺，數碼生物顯微鏡下電子顯微鏡，電泳儀，凝膠成像儀，梯度PCR儀(美國伯樂)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離與純化

1.2.1.1 富集培養 將獼猴桃腐爛部位用無菌水清洗干凈，用滅菌后的鑷子，對于每個品種，分別取不同腐爛部位各5g，總共25g，置于裝有225mL無菌水的500mL三角瓶中搖勻，振蕩20min，放于含有鏈霉素的馬鈴薯液體培養基中再振蕩搖勻，然后置于28℃的恒溫培養箱中培養3d，再進行分離與純化。

1.2.1.2 分離與純化［8－11］稀釋平板法:進行10倍梯度稀釋，依次稀釋成10－2、10－3、10－4、10－5、10－6mL稀釋液。在28℃，相對濕度90%恒溫恒濕下倒置培養，3d后觀察菌株的生長狀況。劃線分離法:觀察菌落形態，用無菌接種環挑取不同形態霉菌菌株的孢子，在菌種純化培養基上作平板劃線，培養條件同上。經一系列的分離、純化、篩選步驟后得到霉菌，然后在4℃冰箱保存。

1.2.1.3 屬的鑒定 將純化后的菌株再次接種培養3d后，用苯酚乳酸染液染色，然后進行鏡檢觀察，結合菌落形態特征，依據鑒定手冊確定屬。

1.2.1.4 種的鑒定 將所純化的青霉菌和木霉菌點接種到PDA、馬丁氏和察氏培養基，在相同條件下培養，記錄不同菌株在不同培養基上的生長速度、菌落顏色、大小以及質地等特征。對純化培養菌株進行產孢結構的觀察，記錄其主要形態、分生孢子的大小以及形狀等特征。

1.2.2 霉菌的ITS序列測定［12－14］

1.2.2.1 總DNA的提取 參照FungalDNAkit真菌基因組DNA提取試劑盒說明操作。

1.2.2.2 ITS區擴增 引物用真菌通用引物正向引物:

ITS1:5'－TCC GTA GGT GAACCT GCG G－3';

ITS4:5'－TCC TCC GCT TA TTGA TA T GC－3'。

PCR反應的總體積為25μL，含有 DNA模板1μg、10μmol·L－1的正向引物和反向引物各1μL，12.5μL的2×Master Mix。

PCR擴增程序:94℃預變性5min，94℃變性50s，50℃退火1min，72℃延伸90s，共34個循環，最后72℃延伸10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，并用UVP凝膠成像分析系統分析擴增后出現的條帶。

DNA純化:采用小量DNA快速回收試劑盒法。1.2.2.3 霉菌的ITS序列分析 將純化后的DNA由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將測得的 ITS區序列通過國際連接直接載入 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行同源性搜索，與已報道真菌菌株的ITS區序列進行同源性比較。

1.2.3 霉菌的生物學特性的測定

1.2.3.1 不同培養基對病原菌產孢量的影響 將PDA培養基、豆芽汁蔗糖培養基、豆芽汁葡萄糖培養基、查氏培養基分別調節pH=7.0，然后制好平板，將5mm滅菌濾紙片蘸取一定濃度的孢子懸浮液接于平板上，在28℃恒溫條件下黑暗中培養，培養7d后用血球計數板測定孢子產生數量。

1.2.3.2 不同光照處理對病原菌產孢量的影響 分別設置24h連續光照、24h連續黑暗、光照/黑暗各12h交替3個處理。其中培養基為PDA(pH=7.0)、培養溫度為28℃、培養時間為7d。

1.2.3.3 不同培養溫度對病原菌產孢量的影響 分別設置0、15、20、25、30、35、40℃7個處理，其中培養基為PDA(pH=7.0)、黑暗中培養、培養時間為7d。

1.2.3.4 不同pH對病原菌產孢量的影響 將PDA培養基滅菌后，無菌條件下用1mol/L的 HCl和1mol/L的NaOH調節pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。然后在培養溫度為28℃恒溫條件下黑暗中培養7d。

1.2.3.5 分生孢子致死溫度的測定 分別設置40、45、50、55、60、65、70、75、80、85℃恒溫水浴鍋中處理20min，后迅速冷卻，之后用移液槍移取200μL到PDA培養基(pH=7.0)上，然后在培養溫度為28℃恒溫條件下黑暗中培養7d。

1.2.3.6 抗紫外線能力的測定 分別設置在紫外線(15W，燈管與培養皿間距52cm)下照射1、3、5、7、9min，以不處理作為對照，然后在培養溫度為28℃恒溫條件下黑暗中培養7d。計算致死率。

致死率(%)=(對照單菌落個數－處理單菌落個數)/對照單菌落個數×100%

2 結果與討論

2.1 形態學鑒定結果

2.1.1 青霉屬的鑒定 青霉菌在28℃、黑暗條件下，PDA培養基上菌落生長局限，菌落為深綠色，質地細膩，中央稍凸起菌落，邊緣為白色、稠密，背面為黃綠色，見圖1－a。在察氏培養基上菌落顏色為乳白色，質地細膩，中央稍凸起有灰色斑點，菌落邊緣為白色或者綠色，背面無色，見圖1－b。在查氏培養基上在數碼顯微鏡下觀察到的帚狀枝對稱或者不對稱、緊密，有兩輪分枝，分生孢子呈卵形、橢圓形或近球形，光滑，呈綠色見圖1－c。

2.1.2 木霉屬的鑒定 菌株在PDA培養基平板上，28℃、黑暗條件下菌落生長速度很快，顏色為深綠色，氣生菌絲體絨狀至粉狀，菌絲為白色，隨著菌落的不斷擴大，從中心開始出現輪狀的產孢區，并逐漸向外擴展;孢子顏色也由白變綠，呈粉末狀，整個菌落整齊而扁平。培養7d后，菌落老熟，正面變為暗綠色，背面無色稀疏(圖2－a)。在查氏培養基上菌落顏色為綠色，在培養皿中分布疏散，背面無色(圖2－b)。在數碼顯微鏡下觀察到的樹枝狀，疏散，分生孢子呈卵形、橢圓形或近球形，光滑，呈綠色。在PDA培養基和查氏培養基上菌落形態和顯微鏡下的圖片見圖2。

表1 五種病原菌在不同培養基上生長特性Table 1 Growth characteristicsofive pathogens in different medium

圖1 青霉菌的形態特征Fig.1 Morphology of Penicillium

圖2 木霉菌的形態特征Fig.2 Morphology of Trichoderma

2.2 分子生物學鑒定結果

2.2.1 菌株ITS PCR電泳結果 將5株霉菌基因組DNA稀釋做模板，用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，得到霉菌的ITS1－5.8S rDNA－ITS4片段，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。測序表明:該霉菌的ITSDNA序列長度大小為500～750bp。

2.2.2 ITS區序列測定 測定基因序列結果顯示，序列長度為579～608bp不等，序列中包含部分18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2及部份28S rRNA，在GenBank中比對結果表明相似度在99%～100%，從而鑒定出這5株致病菌為:Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum 和 Trichoderma longibrachiatum。并且在 GenBank數據庫中登錄號分別為: AB505424.1、GU566251.1、AY373902.1、AB479335.1、EU401572.1。

2.3 生物學特性測定結果

2.3.1 不同培養基對病原菌產孢量的影響 如表1所示，在豆芽汁培養基上菌絲生長量較大，菌落最厚，其次為PDA培養基，在察氏培養基上生長量最小。產孢情況:Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum和Penicillium paneum三株青霉菌在豆芽汁葡萄糖培養基上產孢量最大，察氏培養基產孢量明顯最小;Penicillium sp.CLF－S菌株在PDA培養基上產孢量最大，察氏培養基產孢量明顯最小; Trichoderma longibrachiatum菌株在豆芽汁蔗糖培養基上產孢量最大，察氏培養基產孢量明顯最小。菌落顏色:四株青霉菌在PDA培養基上生長顏色為灰綠色或黃綠色，在察氏培養基上基本為乳白色或白綠色，而在豆芽汁葡萄糖和豆芽汁蔗糖培養基上生長顏色為深綠色或黃綠色;木霉菌株在PDA培養基上生長顏色為白綠色，在察氏培養基上基本為綠色，而在豆芽汁葡萄糖和豆芽汁蔗糖培養基上生長顏色為深綠色。

2.3.2 不同光照處理對病原菌產孢量的影響 如圖3所示，光照、黑暗及光暗交替對五種菌產孢量有明顯影響，其中光照處理產孢量顯著高于其他兩者(P≤0.05)。

表2 孢子致死溫度的測定Table 2 Determination of spore lethal temperature

圖3 光照處理對產孢的影響Fig.3 Effect of illumination on the spore number

2.3.3 不同培養溫度對病原菌產孢量的影響 如圖4所示，木霉在15～40℃之間均能產孢，但在25～35℃之間產孢量較高。其中30℃產孢量最多，明顯高于20℃時的產孢量。其它四株青霉菌也在25～35℃產孢量較高，但產孢量明顯低于木霉菌。

圖4 培養溫度對產孢量的影響Fig.4 Effect of incubation temperature on the Spore number

2.3.4 不同pH對病原菌產孢量的影響 如圖5所示，五種霉變微生物都有其相適應的生長pH范圍，并且對pH的適應范圍都比較廣，在pH 2～8范圍內均可產孢值，在pH為6～7時產孢量為最佳，pH＜2及pH＞8時菌株產孢量明顯下降，且各pH間沒有明顯差異。

2.3.5 五種病原菌分生孢子致死溫度的測定 如表2所示，五種病原菌的致死溫度較高，其中Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum 致 死 溫 度 為 80℃，時 間 20min; Penicillium paneum和 Trichoderma longibrachiatum致死溫度為 85℃，時間 20min，這表明 Penicillium paneum和Trichoderma longibrachiatum最耐熱。

2.3.6 抗紫外線能力的測定 實驗結果見圖6，從圖6中可知，對5株菌株分別進行1、3、5、7、9min的紫外線輻照處理，不同霉菌致病菌之間的抗紫外能力存在一定的差異。相同時間的紫外輻照條件下，五種霉菌孢子致死率差異顯著。隨著紫外輻照時間的延長，不同病原菌株的致死率逐漸增加，當增加到一定程度，病原菌必將完全死亡。其中 Penicillium purpurogenum紫外能力最弱，輻照9min時致死率為92.45%，而Penicillium chrysogenum抗紫外能力最強，輻照9min的致死率為72.73%。因紫外燈的功率和照射距離固定，所以其殺菌效果只與照射時間的長短有關，呈線性相關，即照射時間越長，其照射范圍內霉菌細胞所接受的輻射劑量越高，殺菌率也越高。

圖5 pH對產孢量的影響Fig.5 Effect of pH on the spore number

圖6 紫外線照射時間對致死率的影響Fig.6 Effect of UV irradiation time on death rate

3 結論

本研究從腐爛的“海沃德”獼猴桃中分離得到5株致病菌，通過形態鑒定確定該5株菌株為木霉屬和青霉屬，并結合分子生物學鑒定，確定為: Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum、Penicillium chrysogenum、Penicillium paneum 和Trichoderma longibrachiatum。然后對其生長培養基、光照、溫度、pH、致死溫度和抗紫外能力等生物學特性進行研究，為今后進一步研究獼猴桃貯藏生物防治提供依據。從生物學特性測定結果可以看出，適于菌株產孢的條件范圍較寬，這與已報道的霉菌特點一致［15－17］。5株菌株在多種培養基上都能正常生長并產孢，這與報道的其它青霉與木霉菌相似。可見光和近紫外光照射可以促進很多真菌的孢子產生，實驗結果表明持續光照處理時，5株菌株的孢子產生數量比黑暗處理明顯高。溫度生長適應范圍較寬，在40℃的較高溫度下也能保持一定的生長存活能力，且能夠產生少量的分生孢子，這說明這5株致病菌有很強的適應性。菌株在30℃時有較大產孢量，而與已報道的多數菌株在30℃時生長最快、產孢量高相一致［18－20］。而致死溫度也有所差異，其中Penicillium sp.CLF－S、Penicillium purpurogenum 和Penicillium chrysogenum的致死溫度為80℃，與已報道的產黃青霉致死溫度低相一致。而 Penicillium paneum和 Trichoderma longibrachiatum致死溫度為85℃，這表明 Penicillium paneum 和 Trichoderma longibrachiatum最耐熱。相同時間的紫外輻照條件下，五種致病菌的致死率差異顯著。隨著紫外輻照時間的延長，不同病原菌株的致死率逐漸增加，當增加到一定程度，病原菌必將完全死亡。其中產紫青霉抗紫外能力最弱，輻照9min的致死率為92.45%，而長枝木霉抗紫外能力最強，輻照9min時致死率高達72.73%。結論表明這5株致病菌之間的生物學特性相比較存在一定差異，因此有必要進一步對其生防效果與作用機理進行研究，為更好研究提高獼猴桃貯藏期提供理論依據。

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Molecular identification and biological characteristics of mould in storage of“Haiwode”kiwi fruit

DUAN Ai－li1，LEI Yu－shan2，GAO Gui－tian1，*，SUN Xiang－yu1，LIANG Jun1
(1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shannxi Normal University，Xi’an 710062，China; 2.Shaanxi Bairui Kiwi Research Institue Co.，Ltd.，Xi’an 710062，China)

Objective:The mould from storage of“Haiwode”kiwi fruit of Zhouzhi country in Shannxi province were isolated and identified，so as to provide a theoretical basis of fresh kiwi fruit for future research.Method:With the molecular identification and morphological characteristic，the species of pathogens were distinguished.By means of the biological characteristics，the differences of pathogens were analysised.Results:Five strains were identified，such as Penicillium sp.CLF－S，Penicillium purpurogenum，Penicillium chrysogenum，Penicillium paneum and Trichoderma longibrachiatum.The biological characteristics of mould were screened and investigated.Bean sprouts medium was the most favorable medium for the spore.It could produced high spore for the continuous light conditions and 30℃，optimal pH 6.0～7.0.The lethal temperature was 80℃and UV capability was from 72.73%to 92. 45%.Conclusion:The mould from storage of“Haiwode”kiwi fruit of Zhouzhi country in Shannxi province were Penicillium and Trichoderma.While the results revealed that the pH and temperature for spore production ranged，the lethal temperature was high，and the UV resistance ability was strength.

kiwi fruit;Haiwode;mould;ITS;biological characteristics

TS255.3

A

1002－0306(2012)10－0321－05

2011－07－13 *通訊聯系人

段愛莉(1986－)，女，在讀研究生，研究方向:食品生物技術、食品安全。

陜西省“13115”科技創新工程重大科技專項(2009ZDKG－05);獼猴桃質量安全技術研究與示范(771845);陜西師范大學自然科學基金優秀項目(995828)。