正交實驗法優化棗核黃酮的超聲提取工藝研究

張吉祥，歐來良

(1.廊坊師范學院化學與材料科學學院，河北廊坊065000; 2.南開大學生物活性材料教育部重點實驗室，分子生物研究所，天津300071)

正交實驗法優化棗核黃酮的超聲提取工藝研究

張吉祥1，歐來良2

(1.廊坊師范學院化學與材料科學學院，河北廊坊065000; 2.南開大學生物活性材料教育部重點實驗室，分子生物研究所，天津300071)

采用正交實驗法優選棗核中總黃酮的最佳超聲提取工藝。以蘆丁為對照品，采用分光光度法進行測定，以棗核中黃酮含量作為考查指標，通過單因素實驗研究超聲波功率、提取時間、提取溫度、料液比和提取溶劑乙醇體積分數對提取效果的影響，再利用正交實驗法優化最佳提取工藝條件。結果表明，對棗核黃酮提取影響的大小次序為提取溫度＞料液比＞提取時間＞乙醇體積分數＞超聲波功率，最佳提取工藝為:提取溫度55℃，料液比為1∶50，提取時間為40min，乙醇體積分數為50%，超聲波功率為400W，在該條件下棗核黃酮粗品的提取率為12.45%，粗品中黃酮含量為6.83mg·g－1，能顯著提高棗核黃酮的提取效率。

正交實驗法，超聲，提取，棗核，總黃酮

紅棗，又名中華大棗、小棗，是鼠李科棗屬植物棗(Zizyphusjujuba Mill)的果實［1］。紅棗果肉營養豐富且含大量生物活性成分如大棗皂甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(ziziphussaponinⅠ，Ⅱ，Ⅲ)、酸棗仁皂甙B(jujuboside B)、光千金藤堿(stepharine)、葡萄糖、果糖、蔗糖、環磷腺苷(cAMP)、環磷烏苷(cGMP)等，具有獨特的營養和藥用價值［2－5］。目前，除對棗肉中有效成分進行研究外，對以往作為廢料丟棄的棗核中有效成分的研究也成為人們關注的課題［6－9］。研究表明，紅棗核含黃酮類成分具有預防心腦血管疾病、防癌抗癌之功效［8－9］。目前，天然產物中有效成分的傳統提取方法有醇滲漉法、浸漬法、索氏抽提法和加熱回流法，但存在提取時間長、溶劑用量大、提取率低等問題。近年來，現代提取技術超聲提取法在環境、生化、食品及天然產物等領域得到了廣泛的應用，具有設備簡單、操作時間短、效率高等優點，已廣泛用于提取天然產物中揮發油、苷類多糖、生物堿等有效成分［10－14］。經查閱，采用超聲法對紅棗核中黃酮類成分進行提取的報導甚少［15］。為此，該實驗以紅棗核為實驗材料，采用正交實驗法，利用超聲提取法對紅棗核中的總黃酮的提取進行研究，旨在獲得最佳提取工藝，為紅棗核的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

蘆丁標準品 中國食品藥品檢定研究院;紅棗棗核樣品 河北滄州金絲小棗棗核;乙醇、氫氧化鈉分析純，天津市北方天醫化學試劑廠;三氯化鋁分析純，天津市虹迪化工有限公司;亞硝酸鈉 分析純，天津市化學試劑一廠。

SK8200HP超聲波清洗器 上海科導超聲有限公司;UV－2550型紫外可見分光光度計 日本島津公司;FA1604N電子天平 上海精密科學儀器有限公司;SHB－Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;RE－52A型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;ZK－82B型真空干燥箱 上海實驗儀器總廠;微孔過濾器 天津津騰實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制［16］精密稱取蘆丁對照品20.0mg，用50%的乙醇水溶液溶解并定容至50mL容量瓶中。分別取此溶液0.00、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00mL于25mL容量瓶中，加30%的乙醇水溶液至10mL，加入5%的NaNO20.30mL搖勻后靜置10min，加入10%AlCl30.30mL，搖勻后靜置10min，加入5% NaOH 4.00mL，加水至刻度搖勻，靜置15min，配制成系列標準溶液，在507nm處測定吸光度，以吸光度對濃度做標準曲線。蘆丁對照品溶液在此濃度范圍內與吸光度成良好線性關系，線性回歸方程為A= 0.01925+13.82C，線性相關系數為r=0.9999，標準曲線的線性范圍為0.0032～0.048mg·mL－1。

1.2.2 提取工藝流程 棗核→洗凈烘干→粉碎過200目篩→加入溶劑→超聲提取→0.45μm微孔濾膜過濾得澄清透明液體→減壓濃縮回收溶劑→真空干燥→得棗核黃酮提取物粗品→計算提取率→計算粗品中黃酮含量。

1.2.3 浸提條件的選擇 研究料液比、乙醇溶液體積分數、溫度、提取時間和超聲波功率對棗核總黃酮提取的影響，首先做單因素實驗考察以上條件對提取率的影響，然后采用正交實驗法優化最佳工藝條件。用分光光度計測定507nm處吸光度值，根據

1.2.1 計算得到棗核中黃酮含量，作為棗核總黃酮提取指標。

1.2.3.1 料液比的選擇 準確稱取5份粉碎的棗核樣品各1.0000g置于250mL錐形瓶中，分別加入體積分數為50%乙醇溶液30、40、50、60、70mL作為溶劑，設定超聲波功率350W，提取溫度25℃，提取時間30min，進行超聲波提取。浸提液經減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測定，在507nm處測定吸光度，計算黃酮提取率。

1.2.3.2 乙醇體積分數的選擇 準確稱取5份粉碎的棗核樣品各1.0000g置于250mL錐形瓶中，分別加入50.00mL乙醇溶液作為溶劑，控制乙醇體積分數為30%、40%、50%、60%、70%，設定超聲波功率350W，提取溫度25℃，提取時間30min，進行超聲提取。浸提液經減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測定，在507nm處測定吸光度，計算黃酮提取率。

1.2.3.3 提取時間的選擇 準確稱取5份粉碎的棗核樣品各 1.0000g置于 250mL錐形瓶中，加入50.00mL 50%的乙醇溶液作為溶劑，設定超聲波功率350W，提取溫度25℃，分別控制提取時間10、20、30、40、50min進行超聲波提取。浸提液經減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測定，在507nm處測定吸光度，計算黃酮提取率。

1.2.3.4 超聲波功率的選擇 準確稱取5份粉碎的棗核樣品各1.0000g置于250mL錐形瓶中，加入50.00mL 50%的乙醇溶液作為溶劑，設定超聲波功率分別為250、300、350、400、450W，提取溫度25℃，超聲提取30min，浸提液經減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測定，在507nm處測定吸光度，計算黃酮提取率。

1.2.3.5 提取溫度的選擇 準確稱取5份粉碎的棗核樣品各 1.0000g置于 250mL錐形瓶中，加入50.00mL 50%的乙醇溶液作為溶劑，設定提取溫度分別為25、35、45、55、65℃，超聲波輻射溫度350W，超聲提取30min，浸提液經減壓抽濾，取一定體積溶液并按1.2.1步驟測定，在507nm處測定吸光度，計算黃酮提取率。

1.2.3.6 最佳工藝條件的選擇 為了獲得以乙醇溶液作為溶劑，超聲提取棗核總黃酮的最佳工藝條件，通過研究料液比、乙醇體積分數、提取時間、超聲波功率和提取溫度等單因素，確定4個水平進行L16(45)實驗(表1)，以黃酮含量為指標，探究超聲提取棗核總黃酮的最佳工藝條件。

表1 L16(45)正交因子水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 棗核黃酮粗品提取產率的計算 將浸提液減壓濃縮回收溶劑，將產品真空干燥得棗核黃酮粗品，粗品的提取產率計算公式為:

式中:ω為棗核黃酮粗品提取產率，%;X為棗核黃酮提取物粗品質量，g;m為棗核質量，g。

1.2.5 棗核黃酮粗品中黃酮含量的計算 準確稱取一定質量的黃酮粗品，溶解并定容至25mL容量瓶中，取一定體積溶液并按1.2.1測定吸光度，將吸光度換算成濃度，計算棗核粗品中黃酮含量。

式中:w為棗核粗品中黃酮純度(質量分數)，%;c為溶液中黃酮濃度，mg·mL－1;V為所取溶液體積，mL;M為棗核粗品質量，g。

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 料液比的選擇 實驗結果見圖1。由圖可知，隨著溶劑量的增加，總黃酮提取率呈現先升高后降低的趨勢。當料液比低于1∶50時，提取率隨著料液比的增大而升高，這是因為提取率的高低與黃酮向溶劑擴散的難易程度有關，料液比小，溶劑量少，導致兩相界面間的濃度差小，不利于黃酮的擴散。但當料液比高于1∶50時，提取率反而降低，不利用工業生產。因此，選定1∶30、1∶40、1∶50和1∶60作為正交實驗中料液比的四個水平。

圖1 料液比對棗核黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of solid－liquid ratio on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.2 乙醇體積分數的選擇 實驗結果見圖2。由圖可知，隨著乙醇體積分數的增大，棗核中總黃酮的提取率先增大后減小。這是因為乙醇對黃酮的溶解度比水大，乙醇對細胞的破壞作用比水強，在超聲波作用下表現得更加明顯。乙醇體積分數在40%～60%時，棗核黃酮提取率較高，考慮到乙醇體積分數過高會增加生產成本。因此，選定30%、40%、50%和60%作為正交實驗中乙醇體積分數的四個水平。

圖2 乙醇體積分數對棗核黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.3 提取時間的選擇 實驗結果見圖3。由圖可知，隨著超聲作用時間的增加，棗核總黃酮的提取率迅速增大，可見提取時間越長，提取越充分。但時間超過30min后，黃酮提取率趨于穩定。因此，選定10、20、30和40min作為正交實驗中提取時間的四個水平。

2.1.4 超聲波功率的選擇 實驗結果如圖4。由圖可知，棗核黃酮的提取率隨超聲波功率的增加而逐漸提高，這是因為隨著超聲波功率的增大，超聲波的空化作用、粉碎作用使細胞膜的結構受到破壞，提高和改善了組織細胞的通透性;此外，超聲波的吸收使超聲波的動能轉化為熱能，使得植物組織內部溫度升高，有利于有機成分的溶出。但超聲波功率大于400W后，棗核黃酮的提取率隨超聲波功率的增加有所降低。因此，選定300、350、400和450W作為正交實驗中超聲波功率的四個水平。

圖3 提取時間對棗核黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

圖4 超聲波功率對棗核黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic－wave power on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.5 提取溫度的選擇 實驗結果見圖5。由圖5可知，隨著提取溫度的上升，棗核中黃酮的提取率呈現逐漸增大的趨勢，但溫度超過55℃，提取率趨于穩定。分析原因是:從較低溫度升至60℃，熱效率升高，分子運動加快，利于黃酮的破壁溶出;但隨著溫度的繼續升高，使部分蛋白凝固從而不利于黃酮溶出，故提取率趨于穩定。據此，選定25℃、35℃、45℃和55℃作為正交實驗中提取溫度的四個水平。

圖5 提取溫度對棗核中黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of temperature on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.6 正交實驗 根據單因素實驗結果，選取影響棗核總黃酮提取因素中有意義的水平做正交實驗，對結果進行極差分析，以確定最佳提取工藝條件。采用L16(45)正交因子水平表(見表1)，設計L16(45)正交實驗，實驗結果見表2。

由表2數據極差分析可知，RE＞RA＞RC＞RB＞RD，各因素對棗核中總黃酮的提取率的影響程度依次為:提取溫度＞料液比＞提取時間＞乙醇體積分數＞超聲功率，溫度對棗核黃酮提取的影響最為顯著，在實驗設計的范圍內，優化得到超聲提取棗核黃酮的最佳條件為:A3B3C4D3E4，即料液比為1∶50，乙醇體積分數為50%，提取時間為40min，超聲波功率為400W，提取溫度55℃。

表2 L16(45)正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 最佳工藝條件的驗證

按A3B3C4D3E4條件進行三次平行實驗，結果見表3所示。

表3 正交實驗優化條件下棗核中黃酮含量Table 3 Extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates under optimal condition with Orthogonal Test

由表3可知，A3B3C4D3E4條件下棗核黃酮提取率高于表2中的實驗結果，故A3B3C4D3E4為最優化實驗條件。

2.3 棗核黃酮提取物粗品的制備

取3份棗核樣品各10.0000g，采用上述最佳提取條件進行提取，得黃酮提取液，再按照1.2.2提取工藝流程，將該溶液進行濃縮精制，得到棗核黃酮粗品，稱量計算得平均質量為1.2451g，計算黃酮粗品提取產率為12.45%，該棗核黃酮粗品中黃酮含量為6.83mg·g－1，約為棗核樣品中黃酮含量的7.8倍。

3 結論

3.1 本實驗采用正交實驗法優選棗核黃酮的最佳提取工藝條件，在最佳實驗條件:料液比1∶50，乙醇體積分數50%，提取時間40min，超聲波功率400W，提取溫度 55℃，得到棗核黃酮粗品的提取率為12.45%，粗品中黃酮含量為6.83%。

3.2 實驗利用超聲提取方法，可以極大地縮短提取時間，且能達到較高的提取效率。因此，超聲提取法是一種較為理想的提取方法，具有省時、高效、節能的優點。

［1］中華人民共和國衛生部藥典委員會.華人民共和國藥典［M］.2005版.北京:化學工業出版社，2005:16.

［2］劉潤平.紅棗的營養價值及其保健作用［J］.中國食物與營養，2009(12):50－52.

［3］王軍，張寶善，陳錦屏.紅棗營養成分及其功能的研究［J］.食品研究與開發，2003，24(2):68－72.

［4］李麗華，陳錦屏.和田玉棗總皂甙的提取工藝研究［J］.食品科學，2008，29(11):261－264.

［5］苗利軍，劉孟軍，彭紅麗，等.棗果中總黃酮含量分析［J］.安徽農業科學，2008，36(22):9460－9461.

［6］郝會芳，王艷輝，苗笑陽，等.棗核中多酚物質提取條件的初步研究［J］.華北農學報，2007，22:S48－S52.

［7］許牡丹，張瑞花，王瑾鋒.棗核中總皂苷提取工藝的研究［J］.食品科技，2011，36(1):181－183.

［8］張志國.冬棗核類黃酮的提取工藝研究及其生物功能初探［D］.西安:陜西師范大學，2006.

［9］張娜，楊保求，王倩，等.棗核黃酮類物質的抗氧化性研究［J］.安徽農業科學，2010，38(35):20037－20039.

［10］鄔方寧.超聲提取技術在現代中藥中的應用［J］.中草藥，2007，38(2):315－316.

［11］葉林，蒲云峰，楊菲菲.超聲波輔助提取苦豆子膠的工藝研究［J］.食品科技，2011，36(5):220－223.

［12］楊芙蓮，聶小偉.微波－超聲波輔助浸提紅棗汁工藝條件優化［J］.食品科技，2011，36(2):96－100.

［13］周向輝，王娜，石聚領，等.微波－超聲波聯合提取棗中環磷酸腺苷的工藝研究［J］.食品科學，2009，30(18):196－201.

［14］易運紅，吳功慶，王蓮婧.金櫻根總皂苷的超聲提取工藝研究［J］.食品工業科技，2011，32(5):270－272.

［15］張春蘭，張銳利，熊素英，等.超聲波輔助提取紅棗核中總黃酮的研究［J］.安徽農業科學，2010，38(12):6503－6505.

［16］張進棠，姚本林，劉伏煌，等.銀杏葉提取物中總黃酮的紫外分光光度測定［J］.武漢化工學院學報，1998，20(1): 26－28.

Study on ultrasonic extraction of total flavone from seeds of Chinese dates with orthogonal test

ZHANG Ji－xiang1，OU Lai－liang2
(1.Faculty of Chemistry and Material Science，Langfang Teachers’College，Langfang 065000，China; 2.Key Laboratory of Bioactive Materials，Ministry of Education，Institute of Molecular Biology，Nankai University，Tianjin 300071)

The optimal condition for ultrasonic extraction of flavone from seeds of Chinese dates was investigated by orthogonal test.The total flavone content of seeds of Chinese dates was determined by using spectrophotometry method with rutin as reference substance.In the single factor analysis，the effect of ultrasonic－wave power，extraction time，extraction temperature，solid－liquid ratio and ethanol(extraction solvent)volume fraction were measured.The orthogonal test was used to optimize the conditions of extraction.The results showed that the order of extraction effectiveness was as follows:extraction temperature＞solid－liquid ratio＞extraction time＞ethanol volume fraction＞ultrasonic－wave power.The optimum conditions were extraction temperature 55℃，solid－liquid ratio1∶50，extraction time 40min，ethanol volume fraction 50%，and ultrasonic－wave power 400W.Under the optimized extraction conditions，the yield of flavone crude product was 12.45%，the content of total flavone was 6.83mg·g－1.The results indicated that operating efficiency of extracting total flavone from seeds of Chinese dates was remarkably increased by orthogonal test and ultrasonic wave extraction.

orthogonal test;ultrasonic－wave;extraction;seeds of Chinese dates;total flavone

TS201.2

A

1002－0306(2012)10－0280－04

2011－09－08

張吉祥(1973－)，男，博士，副教授，研究方向:天然產物中有效成分的提取與分離。

河北省教育廳青年基金資助項目(2010156)。