固相微萃取法分析納豆揮發性成分

黃 璇，廖盧艷，范 琳，白 亮，梁一博，蔣立文，*

(1.湖南農業大學東方科技學院，湖南長沙410128; 2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128; 3.湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南長沙410128)

固相微萃取法分析納豆揮發性成分

黃 璇1，廖盧艷1，范 琳2，3，白 亮1，梁一博1，蔣立文2，3，*

(1.湖南農業大學東方科技學院，湖南長沙410128; 2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128; 3.湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南長沙410128)

目的:分析納豆中的的主要揮發性成分。方法:采用固相微萃取法提取、富集納豆中的揮發性成分，用氣相色譜－質譜法(GC－MS)對其化學成分進行鑒定，用峰面積歸一化法計算各組分相對百分含量。結果:共鑒定出55種有機成分，揮發性有機物成分為47種，占總含量的80.49%，主要包括酮類、吡嗪類、醇類、酸類等15類有機揮發物。結論:納豆揮發性成分主要為川芎嗪(26.223%)、2，5－二甲基吡嗪(23.835%)、2，3－丁二酮(15.648%)、三甲基吡嗪(13.484%)、三甲基惡唑(4.947%)、2－乙基－3，6－二甲基吡嗪(2.833%)、丙酸2－羥基－1－甲基乙基酯(1.803%)、2，3，5－三甲基－6－川芎嗪(1.758%)、3－羥基－2－丁酮(1.676%)、醋酸乙烯基酯(1.377%)等。

納豆，揮發性成分，固相微萃取，GC－MS

日本的納豆自須見洋行分離枯草芽孢桿菌(又名納豆菌)以來，其生理保健作用得到深入研究，特別是含有溶栓效果的納豆激酶使其成為世界上知名的藥食同源發酵大豆制品［1］，每年納豆的市場產值達到30億美元。目前納豆方面的專利達到286項，在我國北京、廣州、深圳等地已建立納豆產品生產基地，產品附加值增加超過10倍以上。納豆可以隨口味來選擇不同調味包食用，但其特有的氨味還不能被中國人普遍接受。隨著現代控制技術的日益發展，發酵產品揮發性成分分析逐漸成為產品重要的控制指標。固相微萃取是最常用的揮發性風味物質樣本采集技術，已廣泛應用于環境、水、食品、香精香料及煙草等樣品中揮發性和半揮發性有機物的分析，具有成本低、無需有機溶劑、所需樣品量少、靈敏度高、重現性好、操作簡單、方便快捷等特點［2－4］。目前在食品方面，被廣泛的用作風味物質的分析檢測。我國有關納豆激酶、納豆抗菌肽等研究非常深入，如董明盛等人對溶栓納豆菌的篩選［5］，納豆激酶穩定性［6］以及納豆及其保健這方面的深入探討［7］等，但是對納豆氣味的改良還不夠深入［8］，目前還沒有從風味改良的方向去解決這個問題。本文采用固相微萃取(SPME)與氣相－質譜聯用技術對日本納豆中的揮發性風味成分進行了較為細致地分析，再以峰面積歸一化法計算各組分在揮發性成分中的相對百分含量，為納豆的揮發性風味物質研究提供參考，為納豆風味改良提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

旭松牌“納豆一番”納豆 生產日期2010年4月26日，其蛋白質含量為13.6%，芽孢桿菌為5× 106cfu/g，氨基酸態氮含量為0.57%，水分為60.3%。

固相微萃取裝置 包括手柄、導向桿;SPME進樣器 上海安譜科學儀器有限公司;GCMS－QP2010氣相色譜－質譜聯用儀 日本島津公司;GL－3250磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 固相微萃取法處理過程為:取3g納豆研磨成樣品，加6mL水，攪勻。置于15mL頂空瓶中，于磁力攪拌器上在60℃加熱平衡后，通過隔墊插入已活化好的 SPME萃取頭(270℃活化30min)，推出萃取頭，頂空吸附40min后，插入GC進樣口解析5min。

1.2.2 色譜條件 柱型采用(30m×0.25mm× 0.25μm)DB－5ms毛細管柱，柱溫采用程序升溫，初溫40℃保持3min，然后以5℃/min升至150℃，接著以10℃/min升至250℃，保持10min，再以20℃/min升至270℃，保持1min;進樣口溫度250℃，采用不分流，載氣He，流量為1.0mL/min。

1.2.3 質譜條件 離子源溫度200℃，電離方式EI，電子能量70eV，燈絲電流150μA，掃描質量范圍33～500m/z。

1.2.4 化合物的鑒定 采用計算機譜庫(NIST)檢索分析，定量采用峰面積歸一化法求各成分相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 納豆揮發性成分離子圖譜

圖1為納豆樣品的總離子流分析譜圖。

圖1 納豆揮發成分的總離子流圖Fig.1 The total ions count chromatogram of volatile components of natto

2.2 納豆揮發性有機物成分及相對含量

在分析微量成分時，圖譜上總會出現因方法帶入的某些雜質峰。這些物質是環狀的硅氧烷為主，與柱溫升高有關。因此在計算風味有機化合物成分時故不予考慮［9］，所得55種揮發性物質，只有47種揮發性有機物質，其成分及相對含量見表1。

由表1可得出，各大類化合物含量及種類前6名的物質見圖2。

圖2 納豆中排名前6大類揮發性有機物總含量Fig.2 The top 6 categories the total content of volatile organic compounds in natto

其中，酮類化合物有10種，含量為17.877%，酯類7種含量為3.335%，吡嗪類6種含量為68.273%，醇類5種含量為2.114%，醛類3種含量為1.109%，烷類3種含量為0.275%，胺類3種含量為0.103%，酸類2種含量為0.826%，苯2種含量為0.331%，醚類1種含量為0.135%，惡唑1種含量為4.947%，咔唑類1種含量為0.106%，哌啶1種含量為0.082%，呋喃1種含量為0.054%，肼1種有0.410%。

由表1可知，揮發性有機物中物質含量最高的為川芎嗪(26.223%)，其次分別為2，5－二甲基吡嗪(23.835%)、2，3－丁二酮(15.648%)、三甲基吡嗪(13.484%)、三甲基惡唑(4.947%)、2－乙基－3，6－二甲基吡嗪(2.833%)、丙酸2－羥基－1－甲基乙基酯(1.803%)、2，3，5－三甲基－6－川芎嗪(1.758%)、3－羥基－2－丁酮(1.676%)、醋酸乙烯基酯(1.377%)等。這些物質中一些具有特別的生物功能，例如，川芎嗪［10］(2，3，5，6－四甲基吡嗪)是中藥川芎中的主要活性生物堿，具有擴張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等多種作用;咔唑類衍生物［11］具有廣泛的生物活性，如抗癌、抗微生物、抗組胺、抗氧化和抗炎等。它們氣味特別，其中，2，3－丁二酮［12］又名雙乙酰，在乳制品、奶油、干酪、奶酪以及許多需要奶味的非乳制品中的一種重要風味物質;吡嗪、吡唑和呋喃是美拉德反應的特征產物，具有肉品的烘烤風味;2，5－二甲基吡嗪具有堅果、馬鈴薯片、巧克力香味;三甲基吡嗪具有濃厚的堅果香氣。值得注意的是，川芎嗪在風味口感中具有特殊異臭味;三甲基惡唑具有強的霉腐氣味且口味略帶苦味;2－乙基－3，6－二甲基吡嗪具有霉味。因此，納豆特殊功效作用的物質可能主要來源包括川芎嗪、三甲基惡唑、2－乙基－3，6－二甲基吡嗪。由實驗結果得出三種物質總含量達到所得揮發性有機物含量的42.54%，這可能是具有特殊氨味的納豆重要營養成分。納豆中主要風味物質可能是具有特殊味道的川芎嗪、三甲基惡唑以及2－乙基－3，6－二甲基吡嗪所致，三者對產品的風味貢獻極大，其他含量極少物質對納豆風味影響的具體情況還有待研究。

3 結論與討論

本研究采用固相微萃取技術(SPME)結合GC－MS方法鑒定了日本納豆中的47種揮發性成分，其主要成分分別為:川芎嗪、2，5－二甲基吡嗪、2，3－丁二酮、三甲基吡嗪。而Tadayoshi Tanaka［13］對納豆的風味成分分析采用單獨氣譜(GC)或氣相色譜－嗅探綜合(GC－sniffing)測試的采集技術，單獨質譜(MS)或質譜和保留系數(mass spectrum and retention index)的檢測方法共檢測出74種揮發性物質，但百分含量超過0.01%的只有22種，且確認了丙酮和異丁酸甲酯是其主要的風味成分，含量分別高達70.84%和13.35%，其次是乙醇(7.35%)、異丁酸乙酯(2.51%)、噻吩(0.32%)等。兩方法都檢測出了乙醇、醋酸乙酯、丁酸乙酯等揮發性成分，但是含量最多的物質存在較大差異，本研究中采用的SPME技術提香測定的成分吡嗪類化合物高達68.273%且酮類化合物含量只有17.87%，與日本學者的丙酮70.84%數據相差甚遠，這與納豆采用工藝不同或者檢測方法不同有密切關聯，說明兩個揮發物提取方法的差異影響到揮發物的峰值，從而導致結果不同。

表1 納豆中揮發性有機物化學成分Table 1 Volatile organic components in natto

本研究表明納豆揮發性成分主要為嗪類、酮類化合物等，這些物質對納豆揮發性成分形成的風味具有重要貢獻作用，因此，研究這些物質可以為進一步確定納豆風味成分研究提供新思路，為更好地改善納豆風味適合更多中國人的口味提供科學依據。

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Analysis of volatile components from natto by solid－phase microextraction

HUANG Xuan1，LIAO Lu－yan1，FAN Lin2，3，BAI Liang1，LIANG Yi－bo1，JIANG Li－wen2，3，*
(1.Orient Science and Technology College of Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China; 3.Hunan Provincial Engineering and Technology Research Centre for Fermented Food，Changsha 410128，China)

Objective:To analyze the natto in the main volatile components.Methods:Solid phase micro extraction and enrichment of volatile components in natto，a gas chromatography mass spectrometry(GC－MS)and its chemical components were identified，with the peak area normalization method to calculate the relative percentage of each component sub content.Results:Identified 55 kinds of chemical composition，47 kinds of volatile organic components of the total content of 80.49%，including pyrazines，pyrroles，pyridines，thiazoles，thiophenes，furans and sulfur components，aldehydes，ketones，alcohols，acids，esters，hydroxybenzenes，hydrocarbon.Conclusion: The main volatile components natto were Tetramethyl pyrazine(26.223%)，2，5－Dimethylpyrazine(23.835%)，2，3－Butanedione(15.648%)，Trimethylpyrazine(13.484%)，trimethyl－Oxazole(4.947%)，2－Ethyl－3，6－dimethylpyrazine(2.833%)，2－hydroxy－1－methylethyl ester(1.803%)，2，3，5－Trimethyl－6－ethylpyrazine (1.758%)，3－hydroxy－2－Butanone(1.676%)，Acetic acid ethenyl ester(1.377%)and so on.

natto;volatile components;solid－phase microextraction;gas chromatography－mass spectrometry (GC－MS)

TS207.3

A

1002－0306(2012)10－0058－04

2011－07－26 *通訊聯系人

黃璇(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術。

湖南省教育廳項目(DFCXS201006)。