夏天無注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬Ang-2和VEGF mRNA表達的影響

曠明麗，余麗梅，張 駿*，吳 芹

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563003；3.遵義醫(yī)學(xué)院貴州省基礎(chǔ)藥理重點實驗室，貴州 遵義 563003）

缺血性腦卒中是臨床常見的急性腦血管疾病，其發(fā)病率、病死率及致殘率很高，故對其防治十分重要。在腦梗死中心壞死區(qū)周圍存在缺血半暗帶，其大量的腦細胞處于休眠或半休眠狀態(tài)，如在一定的治療時間窗 (1～3 h)內(nèi)通過有效的治療，使原來閉塞的腦動脈血管重新通暢或建立新的側(cè)枝循環(huán)，則可使它們的神經(jīng)功能得到逐漸恢復(fù)。

夏天無注射液是從中藥中提取的中藥注射劑，主要含有普魯托品等有效成分，臨床已用于治療腦血管病后遺癥、坐骨神經(jīng)痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。研究表明夏天無中提取的夏天無總堿可抑制大鼠血栓形成，減輕腦栓塞引起的腦水腫［1］；對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，可減輕氧化損傷［2］。夏天無注射液對腦缺血損傷也具有保護作用，并可抑制神經(jīng)元凋亡等［3］，還可增加血管性癡呆大鼠海馬血管生成素-1的表達［4］。本研究制備大鼠腦缺血再灌注模型，觀察夏天無注射液的保護作用，同時分析對大鼠海馬血管生成相關(guān)的血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)和血管內(nèi)皮細胞生長因子 (Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達的影響，以探討夏天無注射液的可能的作用機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑 夏天無注射液 (批號:06102001，2 mL含阿片堿0.4 mg)系江西天施康中藥股份有限公司產(chǎn)品；尼莫地平注射液 (批號:0203011，2 mg/10 mL)為山東新華制藥股份有限公司產(chǎn)品；TTC購自上海山蒲化工有限公司；組織細胞RNA抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司；RT試劑盒、Trizol試劑購自TaKaRa生物工程公司(試劑型號:D312)；Ang-2 mRNA引物由美國Sigma公司合成；SYBR GREEN PCR Master Mix為美國ABI公司產(chǎn)品；0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)滅菌水、乙醇、異丙醇、三氯甲烷等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器 SHZ-88A往復(fù)式水浴恒溫器 (江蘇太倉市實驗設(shè)備廠)；電子天平 (德國賽多利斯公司)；TU-1810紫外分光光度計 (北京普析通用分析儀器公司)；XW-80A旋渦混合器 (寧波新芝科器研究所)；Eppendorf Centrifuge 5417R離心機及逆轉(zhuǎn)錄儀 (德國 Eppendorf)；BeckMAN CoulTER離心機 (美國貝克曼公司)；iCycler熒光定量PCR儀 (美國BIO-RAD)；－80℃低溫冰箱 (日本三洋公司)。

1.3 動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由第三軍醫(yī)大坪醫(yī)院動物中心提供，均為清潔級動物［生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)20020004］，手術(shù)前大鼠分組飼養(yǎng)，自由飲食。

2 方法

2.1 MCAO模型的制備和分組 20% 水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠 (0.18 mL/kg)，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈等，參照文獻 ［5］，線栓法制備大腦中動脈阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，阻斷大腦中動脈血液供應(yīng)，結(jié)扎固定線栓，縫合皮膚切口，栓線外留10 mm。待缺血2 h后再輕拉線頭，使栓線頭端退至頸總動脈切口處，實現(xiàn)再灌注22 h，術(shù)中室溫保持在25℃。假手術(shù)組栓線插入深度為10 mm。

實驗動物分為7組，分別為:正常組、假手術(shù)組、模型組、夏天無注射液高 (0.05 mL/kg)、中 (0.025 mL/kg)、低 (0.01 mL/kg)劑量組和尼莫地平 (0.01 mL/kg)對照組，給藥組缺血2 h再灌注前30 min肌肉注射相應(yīng)藥物各1次，正常組、假手術(shù)組及模型組肌肉注射等體積生理鹽水。

2.2 神經(jīng)功能評價 如表1所示，參考Menzies SA［6］的標準給予評分。缺血2 h后評分在3分及以上者視為模型成功。

表1 腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分

2.3 腦組織梗死面積測定 模型成功者隨機每組取大鼠8只，術(shù)后24 h斷頭取腦，去除嗅球、小腦及低位腦干，以冷生理鹽水去表面血跡，置－80℃低溫冰箱中7～8 min，凍成半硬狀，冠狀切片分成腦組織5片，然后迅速將腦片置5 mL含有1%氯化三苯四氮唑 (triphenyltetrazolium chloride，TTC)及0.1 mL含有1 mol/L K2HPO4溶液中，避光37℃溫孵30 min，其間每隔7～8 min翻動一次，染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色；用比重法測定出梗死比重，即梗死腦組織占全腦質(zhì)量的百分比 (%)=梗死腦組織質(zhì)量/全腦質(zhì)量×100%(均為濕質(zhì)量)。

2.4 RT real-time PCR 按試劑盒說明進行操作，用Trizol試劑和組織細胞RNA抽提試劑盒提取大鼠海馬組織RNA，紫外分光光度計測定D(260)和D(280)，計算D(260)/D(280)比值和RNA濃度，在1.8～2.0范圍內(nèi)者，按TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書，在 Mastercycler Gradient PCR儀逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件為:37℃15 min，85℃ 5 s。按SYBR GREEN PCR Master MIX(美國ABI公司)操作說明，進行定量 PCR檢測。反應(yīng)條件:95℃8 min，1 Cycle；95℃ 15 s；60℃ 1 min，40 Cycles；β-actin的退火溫度為60.2℃，VEGF的退火溫度則為55℃。以βactin的mRNA表達水平為100%，計算Ang-2和VEGF mRNA表達水平。所測基因引物序列見表2。

表2 擴增基因引物序列

2.5 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 ()表示。組間比較 mRNA水平差異大于或等于2倍以上者，t檢驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響 大鼠腦缺血2 h再灌注22 h后，假手術(shù)組和正常組大鼠神經(jīng)功能評分均為0分；與模型組比較，夏天無注射液中、高劑量組和尼莫地平組均可降低神經(jīng)功能學(xué)評分 (P＜0.05)，而夏天無注射液低劑量組對神經(jīng)功能評分無顯著改善。且夏天無注射液中、高劑量組降低神經(jīng)功能學(xué)評分作用較夏天無注射液低劑量組顯著 (見表3，P＜0.05)。

表3 對腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響(，n=8)

表3 對腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響(，n=8)

注:與模型組比較，*P＜0.05；與夏天無注射液低劑量組比較，#P＜0.05。

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3.2 對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍的影響 大鼠腦缺血2 h/再灌注22 h后，TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組與正常組一樣，未出現(xiàn)梗死灶。與模型組比較，夏天無注射液中、高劑量組和尼莫地平組均可降低腦梗死面積 (分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，而夏天無注射液低劑量組對腦梗死面積無顯著改善。且夏天無注射液中、高劑量組降低腦梗死范圍作用較夏天無注射液低劑量組顯著 (見表4、圖1，P＜0.05)。

表4 對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍的影響 (，n=8)

表4 對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍的影響 (，n=8)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與夏天無注射液低劑量組比較，#P＜0.05。

分組 劑量/(mL·kg－1) 梗死面積/%正常組0.01 0假手術(shù)組 0.01 0模型組 0.01 0.32±0.08尼莫地平組 0.01 0.24±0.06*夏天無注射液低劑量組 0.01 0.29±0.07夏天無注射液中劑量組 0.025 0.21±0.05＊＊#夏天無注射液高劑量組 0.05 0.23±0.05*#

3.3 對腦缺血2 h/再灌注22 h大鼠海馬內(nèi)Ang-2和VEGF mRNA水平的影響 大鼠腦缺血2 h/再灌注22 h后，與正常組及假手術(shù)組比較，模型組及夏天無注射液中、高劑量組海馬組織Ang-2和VEGF mRNA均顯著增高 (P＜0.05)。夏天無注射液中、高劑量組與模型組比較，海馬組織Ang-2 mRNA的表達進一步顯著增加 (見表5，P＜0.05)。

圖1 夏天無注射液對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍的影響 (TTC染色)

表5 對腦缺血2 h/再灌注22 h大鼠海馬內(nèi)Ang-2和VEGF mRNA水平的影響(，n=3)

表5 對腦缺血2 h/再灌注22 h大鼠海馬內(nèi)Ang-2和VEGF mRNA水平的影響(，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.05，與正常組、假手術(shù)組比較，#P＜0.05。

分組 劑量/(mL·kg－1)mRNA 的表達水平Ang-2 VEGF正常組0.01 32.00±19.73 20.20±12.22假手術(shù)組 0.01 33.20±27.13 21.40±22.95模型組 0.01 68.78±10.45# 49.30±12.98#夏天無注射液中劑量組0.025 142.21±19.48*# 127.27±20.43*#夏天無注射液高劑量組0.05 352.85±26.38*# 179.97±24.82*#

4 討論

血管的生成是一個復(fù)雜過程，受到許多正負向調(diào)節(jié)關(guān)鍵分子如血管生長因子和抑制血管生長因子的調(diào)控，正常生理狀態(tài)下，機體內(nèi)的血管一經(jīng)新生即保持高度的穩(wěn)定性。缺血性腦損傷后是否有血管生成是其康復(fù)的關(guān)鍵之一，涉及原有血管破壞、血管內(nèi)皮細胞增生、出芽、新生血管形成和構(gòu)建穩(wěn)定的血管網(wǎng)絡(luò)的過程。VEGF是最常見的血管生長因子之一，可作用于血管內(nèi)皮細胞的特異性多功能因子，參與腦缺血后腦組織的病理修復(fù)過程［7］。腦缺血后，缺血區(qū)特別是缺血半暗帶VEGF表達上調(diào)刺激了內(nèi)皮細胞增生，從而形成新的血管，且VEGF貫串血管新生的整個過程，并能在內(nèi)皮細胞內(nèi)誘導(dǎo)抗凋亡蛋白，從而維持新生血管中內(nèi)皮細胞的生存［8］，VEGF還具有減少腦梗死面積，減輕腦水腫的作用［9-10］。

血管生成素/血管生成素受體 (Tie)通路是調(diào)節(jié)血管生成的另一重要信息途徑，在血管的發(fā)生、成熟和維持血管的完整性與穩(wěn)定性等方面扮演著重要角色［11-12］，可減輕炎癥反應(yīng)和降低血管通透性等。Ang-2作為血管生成素家族中的一員，由血管內(nèi)皮細胞合成，參與引發(fā)內(nèi)膜去穩(wěn)定、打破血管的穩(wěn)定信號、導(dǎo)致血管消退、啟動血管形成信號、促進血管形成等作用［13］。Ang-2對血管生成的影響與局部微環(huán)境有關(guān)，當(dāng)VEGF存在時Ang-2則破壞血管的穩(wěn)定，迅速重塑血管基底膜，激活內(nèi)皮細胞增殖、侵襲、遷移、血管出芽、周細胞和平滑肌細胞聚集黏附，形成新生血管，并使血管管徑增粗，通透性增加［14-15］，即參與血管消退、血管形成和血管網(wǎng)的重建；無VEGF時，激活的內(nèi)皮細胞則發(fā)生凋亡，血管發(fā)生退行性變，血管的新生受到抑制。

本研究結(jié)果顯示，腦缺血/再灌注損傷后，大鼠的神經(jīng)功能評分明顯增高，出現(xiàn)較大面積的腦梗死，同時發(fā)現(xiàn)，海馬組織的Ang-2和VEGF mRNA表達明顯增高，這與文獻報道一致［16-18］，進一步證實在破壞血管穩(wěn)定和啟動新生血管形成中的Ang-2和VEGF的一致升高。值得注意的是與模型組比較，夏天無注射液治療后，腦缺血2 h/再灌注22 h大鼠的神經(jīng)功能評分明顯改善，且腦梗死面積明顯縮小，表明夏天無注射液對腦缺血/再灌注損傷具有明顯的保護作用。此外，與模型組比較，夏天無注射液治療組 Ang-2、VEGF mRNA的表達進一步升高，提示:夏天無注射液在促進梗死區(qū)血管消退，增強血管新生信號表達，加速血管內(nèi)皮細胞增生，啟動血管新生方面可能發(fā)揮著重要作用。但夏天無注射液在腦缺血/再灌注損傷修復(fù)期中是否通過血管生成從而促進損傷后修復(fù)值得進一步探討。

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